本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15的抗原性及其代謝動(dòng)力學(xué)　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是一種普遍存在的人畜共患病原菌,其可以造成多種局部和全身性感染,具有高發(fā)病率和死亡率。由金黃色葡萄球菌引起的感染是威脅人類健康的主要問(wèn)題。嚴(yán)重地威脅人類的健康和公共衛(wèi)生安全。近些年,由于多重耐藥金黃色葡萄球菌的廣泛流行,給該菌造成感染的治療帶來(lái)了巨大的困難。噬菌體裂解酶可以高效、特異地裂解細(xì)菌,因其與抗生素的作用機(jī)制完全不同,是新概念的抗菌物質(zhì),有著很大的研究與應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究過(guò)程中獲得了金黃色葡萄球菌的噬菌體裂解酶(LysGH15),該裂解酶對(duì)金黃色葡萄球菌具有廣譜、高效裂解活性,不但可以殺滅抗生素敏感的金葡菌,對(duì)多重耐藥的金葡菌同樣有效;已成功解析了LysGH15的三維結(jié)構(gòu)、揭示了其高效殺菌活性的分子作用機(jī)制;LysGH15在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的治療效果。但作為一種潛在的新型蛋白酶類藥物,LysGH15是否會(huì)誘導(dǎo)金葡菌產(chǎn)生耐藥性,其在體內(nèi)的抗原性和代謝動(dòng)力學(xué)尚不清楚,而這是其作為藥用必須回答的科學(xué)問(wèn)題。因此,本論文將繼續(xù)深入研究LysGH15,以揭示LysGH15重復(fù)應(yīng)用之后,金葡菌是否能夠產(chǎn)生針對(duì)其的耐藥性,LysGH15進(jìn)入體內(nèi)后能否刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,所產(chǎn)生的抗體是否會(huì)對(duì)其體內(nèi)的療效產(chǎn)生不利影響;重復(fù)和大劑量應(yīng)用該裂解酶是否會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷;通過(guò)免疫學(xué)鑒定法,深入研究該裂解酶在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性。為進(jìn)一步的驗(yàn)證裂解酶LysGH15在治療不同感染模型過(guò)程中的抗藥性及免疫原性,本論文還對(duì)裂解酶LysGH15在治療小鼠皮膚燒燙傷的效果進(jìn)行了深入研究。首先,我們發(fā)現(xiàn)LysGH15在與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)菌株重復(fù)作用之后,未引起金葡菌產(chǎn)生針對(duì)LysGH15的抗性,且每一代作用的菌株對(duì)LysGH15的敏感性沒(méi)有變化。表明在實(shí)驗(yàn)期間,LysGH15不會(huì)誘導(dǎo)金葡菌產(chǎn)生抗性。進(jìn)一步的體內(nèi)研究表明,LysGH15可以刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)LysGH15的特異性抗體,在一次性應(yīng)用后第三周抗體水平為(1:512),且主要為Ig G。將LysGH15多次重復(fù)免疫大白兔之后得到了高免血清,將血清中的抗體進(jìn)行純化。體外活性實(shí)驗(yàn)表明抗體不影響LysGH15對(duì)金黃色葡萄球菌的結(jié)合能力和裂解活性。進(jìn)一步的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)用LysGH15一次性免疫的小鼠抗體滴度達(dá)到最高時(shí),單次靜脈注射LysGH15(50μg)仍然可以有效地治療被致死劑量感染的小鼠模型,治療效果未受到影響。為了分析LysGH15在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué),本研究以制備并純化的無(wú)標(biāo)簽LysGH15-165(CHAP片段)的兔源多克隆抗體為包被抗體,同時(shí)以HRP標(biāo)記的抗HIS標(biāo)簽的單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立了一種靈敏的雙抗體夾心方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最后的包被抗體(LysGH15-165)與檢測(cè)抗體(HRP-anti-HIS)的稀釋比例為包被抗體(1:800)(3.2μg/m L),檢測(cè)抗體(1:1600)(0.6μg/m L);以純化后LysGH15蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該方法進(jìn)行了平行度、準(zhǔn)確度(日內(nèi)和日間變異)、穩(wěn)定性的檢測(cè)。實(shí)用工作范圍約為0.6-300μg/m L,回收范圍從91.2至100.53%,而日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度的變異系數(shù)分別為≤8.31%和≤12.81%。當(dāng)不同濃度的裂解酶溶液在-80℃反復(fù)凍存1次、2次及3次,其回收率會(huì)明顯下降(40.87%-77.23%),但是當(dāng)裂解酶保存在-80℃1個(gè)月、2個(gè)月以及4個(gè)月,其回收率在84.18%-101.61%,說(shuō)明血漿樣品(含有LysGH15)在-80℃放置4個(gè)月穩(wěn)定,沒(méi)有降解。并且也考察了主要的組織器官,心、肝、脾、肺、腎、胃、腸及肌肉注射點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Sandwich-ELISA)方法的準(zhǔn)確度(日內(nèi)和日間變異)、穩(wěn)定性。本研究以尾靜脈注射裂解酶LysGH15的方式,檢測(cè)其在血液中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),給予每只大鼠劑量12.5 mg/kg裂解酶及buffer,藥物在血漿中的消除半衰期t1/2:mean=10.529 h;AUC(0-t):mean=320.164 mg/L*h;AUC(0-∞):mean=345.986 mg/L*h;達(dá)峰時(shí)間Tmax:mean=0.083h;最大血藥濃度Cmax:mean=195.839 mg/L;平均滯留時(shí)間MRT為3.928 h;大鼠在每只給藥劑量12.5 mg/kg裂解酶1h,LysGH15主要分布在血液、小腸、腎中,其中小腸的含量最大,在注射6h后,LysGH15主要分布在腎、胃、小腸內(nèi),在血液中的含量已經(jīng)較小;給藥24h后小腸、腎臟、胃中藥物含量減少,但能檢測(cè)到其存在。通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明應(yīng)用LysGH151h之后,即可在小腸、腎臟、胃檢測(cè)到裂解酶;而6h后,在腎、腸和胃可以檢測(cè)到較高的裂解酶的含量;24h后,藥物在減少,但仍可以觀測(cè)到。對(duì)裂解酶LysGH15進(jìn)行了急性毒性及亞慢性毒性測(cè)定,在急性毒性試驗(yàn)中,通過(guò)腹腔一次性使用高劑量LysGH15(10 mg)并未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物機(jī)體有不適癥狀,主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸)也無(wú)病理變化。對(duì)雌雄大鼠腹腔注射并給予不同濃度劑量的LysGH15連續(xù)注射4周,其血液學(xué)指標(biāo)和血生化指標(biāo)均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),說(shuō)明長(zhǎng)期注射LysGH15不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性反應(yīng);且HE切片染色也未發(fā)現(xiàn)病理變化。為進(jìn)一步的驗(yàn)證裂解酶LysGH15在治療不同感染模型過(guò)程中的抗藥性及免疫原性,本實(shí)驗(yàn)還建立了小鼠皮膚燒燙傷感染模型,并且評(píng)價(jià)了裂解酶LysGH15在體外燒燙傷模型中的治療潛力。首先將LysGH15和中藥單體芹菜素api加入到Aquaphor中以形成LAA軟膏,LAA軟膏同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌活性和溶血抑制活性。在MRSA的小鼠皮膚感染模型中,LAA治療組傷口皮膚中的細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)在處理后18小時(shí)內(nèi)約為102 CFU/mg(最終檢測(cè)不到),而未治療組的小鼠皮膚菌落計(jì)數(shù)約為106 CFU/mg。LAA軟膏在治療小鼠感染MRSA的皮膚模型中有效降低了促炎細(xì)胞因子的分泌、加速皮膚傷口愈合、促進(jìn)傷口組織中巨噬細(xì)胞Ⅱ型相關(guān)標(biāo)志物(精氨酸酶I和YM1)的轉(zhuǎn)錄水平。本研究為將LysGH15作為治療耐藥金葡菌感染的新型抗菌蛋白酶類藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

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