本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15的抗原性及其代謝動力學　出處：《吉林大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是一種普遍存在的人畜共患病原菌,其可以造成多種局部和全身性感染,具有高發(fā)病率和死亡率。由金黃色葡萄球菌引起的感染是威脅人類健康的主要問題。嚴重地威脅人類的健康和公共衛(wèi)生安全。近些年,由于多重耐藥金黃色葡萄球菌的廣泛流行,給該菌造成感染的治療帶來了巨大的困難。噬菌體裂解酶可以高效、特異地裂解細菌,因其與抗生素的作用機制完全不同,是新概念的抗菌物質,有著很大的研究與應用潛力。本實驗室在前期研究過程中獲得了金黃色葡萄球菌的噬菌體裂解酶(LysGH15),該裂解酶對金黃色葡萄球菌具有廣譜、高效裂解活性,不但可以殺滅抗生素敏感的金葡菌,對多重耐藥的金葡菌同樣有效;已成功解析了LysGH15的三維結構、揭示了其高效殺菌活性的分子作用機制;LysGH15在體內表現(xiàn)出良好的治療效果。但作為一種潛在的新型蛋白酶類藥物,LysGH15是否會誘導金葡菌產(chǎn)生耐藥性,其在體內的抗原性和代謝動力學尚不清楚,而這是其作為藥用必須回答的科學問題。因此,本論文將繼續(xù)深入研究LysGH15,以揭示LysGH15重復應用之后,金葡菌是否能夠產(chǎn)生針對其的耐藥性,LysGH15進入體內后能否刺激機體產(chǎn)生抗體,所產(chǎn)生的抗體是否會對其體內的療效產(chǎn)生不利影響;重復和大劑量應用該裂解酶是否會對機體造成損傷;通過免疫學鑒定法,深入研究該裂解酶在體內的藥代動力學特性。為進一步的驗證裂解酶LysGH15在治療不同感染模型過程中的抗藥性及免疫原性,本論文還對裂解酶LysGH15在治療小鼠皮膚燒燙傷的效果進行了深入研究。首先,我們發(fā)現(xiàn)LysGH15在與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)或甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)菌株重復作用之后,未引起金葡菌產(chǎn)生針對LysGH15的抗性,且每一代作用的菌株對LysGH15的敏感性沒有變化。表明在實驗期間,LysGH15不會誘導金葡菌產(chǎn)生抗性。進一步的體內研究表明,LysGH15可以刺激小鼠產(chǎn)生針對LysGH15的特異性抗體,在一次性應用后第三周抗體水平為(1:512),且主要為Ig G。將LysGH15多次重復免疫大白兔之后得到了高免血清,將血清中的抗體進行純化。體外活性實驗表明抗體不影響LysGH15對金黃色葡萄球菌的結合能力和裂解活性。進一步的體內治療實驗表明,當用LysGH15一次性免疫的小鼠抗體滴度達到最高時,單次靜脈注射LysGH15(50μg)仍然可以有效地治療被致死劑量感染的小鼠模型,治療效果未受到影響。為了分析LysGH15在大鼠體內的藥代動力學,本研究以制備并純化的無標簽LysGH15-165(CHAP片段)的兔源多克隆抗體為包被抗體,同時以HRP標記的抗HIS標簽的單克隆抗體作為檢測抗體,建立了一種靈敏的雙抗體夾心方法。通過實驗確定最后的包被抗體(LysGH15-165)與檢測抗體(HRP-anti-HIS)的稀釋比例為包被抗體(1:800)(3.2μg/m L),檢測抗體(1:1600)(0.6μg/m L);以純化后LysGH15蛋白為標準品對該方法進行了平行度、準確度(日內和日間變異)、穩(wěn)定性的檢測。實用工作范圍約為0.6-300μg/m L,回收范圍從91.2至100.53%,而日內和日間準確度的變異系數(shù)分別為≤8.31%和≤12.81%。當不同濃度的裂解酶溶液在-80℃反復凍存1次、2次及3次,其回收率會明顯下降(40.87%-77.23%),但是當裂解酶保存在-80℃1個月、2個月以及4個月,其回收率在84.18%-101.61%,說明血漿樣品(含有LysGH15)在-80℃放置4個月穩(wěn)定,沒有降解。并且也考察了主要的組織器官,心、肝、脾、肺、腎、胃、腸及肌肉注射點夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(Sandwich-ELISA)方法的準確度(日內和日間變異)、穩(wěn)定性。本研究以尾靜脈注射裂解酶LysGH15的方式,檢測其在血液中的藥代動力學參數(shù),給予每只大鼠劑量12.5 mg/kg裂解酶及buffer,藥物在血漿中的消除半衰期t1/2:mean=10.529 h;AUC(0-t):mean=320.164 mg/L*h;AUC(0-∞):mean=345.986 mg/L*h;達峰時間Tmax:mean=0.083h;最大血藥濃度Cmax:mean=195.839 mg/L;平均滯留時間MRT為3.928 h;大鼠在每只給藥劑量12.5 mg/kg裂解酶1h,LysGH15主要分布在血液、小腸、腎中,其中小腸的含量最大,在注射6h后,LysGH15主要分布在腎、胃、小腸內,在血液中的含量已經(jīng)較小;給藥24h后小腸、腎臟、胃中藥物含量減少,但能檢測到其存在。通過免疫組化實驗進一步證明應用LysGH151h之后,即可在小腸、腎臟、胃檢測到裂解酶;而6h后,在腎、腸和胃可以檢測到較高的裂解酶的含量;24h后,藥物在減少,但仍可以觀測到。對裂解酶LysGH15進行了急性毒性及亞慢性毒性測定,在急性毒性試驗中,通過腹腔一次性使用高劑量LysGH15(10 mg)并未發(fā)現(xiàn)動物機體有不適癥狀,主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸)也無病理變化。對雌雄大鼠腹腔注射并給予不同濃度劑量的LysGH15連續(xù)注射4周,其血液學指標和血生化指標均在標準范圍內,說明長期注射LysGH15不會對機體產(chǎn)生毒性反應;且HE切片染色也未發(fā)現(xiàn)病理變化。為進一步的驗證裂解酶LysGH15在治療不同感染模型過程中的抗藥性及免疫原性,本實驗還建立了小鼠皮膚燒燙傷感染模型,并且評價了裂解酶LysGH15在體外燒燙傷模型中的治療潛力。首先將LysGH15和中藥單體芹菜素api加入到Aquaphor中以形成LAA軟膏,LAA軟膏同時表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的殺菌活性和溶血抑制活性。在MRSA的小鼠皮膚感染模型中,LAA治療組傷口皮膚中的細菌菌落計數(shù)在處理后18小時內約為102 CFU/mg(最終檢測不到),而未治療組的小鼠皮膚菌落計數(shù)約為106 CFU/mg。LAA軟膏在治療小鼠感染MRSA的皮膚模型中有效降低了促炎細胞因子的分泌、加速皮膚傷口愈合、促進傷口組織中巨噬細胞Ⅱ型相關標志物(精氨酸酶I和YM1)的轉錄水平。本研究為將LysGH15作為治療耐藥金葡菌感染的新型抗菌蛋白酶類藥物提供堅實的理論與實驗基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

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