本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因抗病蟲與高賴氨酸水稻的改良研究　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水稻是最重要的糧食作物之一,同時也是世界超過一半人口的主糧。然而近些年來,水稻病蟲害嚴(yán)重的影響了水稻的產(chǎn)量,對糧食安全產(chǎn)生巨大的威脅。目前防治水稻病蟲害的方法主要是依賴化學(xué)殺蟲、殺菌劑,雖然在一定程度上控制了其危害的程度,但是化學(xué)噴施同時造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染,而且費(fèi)時費(fèi)力,因此急需替代的方法。與此同時,由于長年以來人們對雜交水稻產(chǎn)量的過分關(guān)注,在一定程度上忽略了雜交水稻品質(zhì)的改良,使得商品糧的稻米品質(zhì)長期停滯不前。因此,綜合改良水稻產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等性狀已迫在眉睫。隨著植物分子生物學(xué)的發(fā)展,使得通過植物基因工程手段來改良水稻病蟲害抗性及稻米品質(zhì)成為了可能。本研究利用常規(guī)雜交及分子標(biāo)記輔助選擇的方法,對含轉(zhuǎn)Bt (crylAb/lAc)基因光溫敏雄性不育系208S進(jìn)行了抗蟲蛋白含量的檢測及其后代Bt基因拷貝數(shù)的分析,并考察了其雜種后代的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。為了改良該不育系的稻瘟病抗性,本研究將208S與聚合了抗稻瘟病基因Pi1、Pi2的恢復(fù)系材料華1517B進(jìn)行雜交轉(zhuǎn)育,獲得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。在稻米品質(zhì)改良方面,本研究對轉(zhuǎn)LYSINE-RICH PROTEIN (LRP)基因材料PA110及其后代進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性及稻米氨基酸含量檢測分析,初步研究了該基因增加種子中賴氨酸含量的分子遺傳機(jī)理。同時通過傳統(tǒng)回交轉(zhuǎn)育并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇的方法將LRP基因?qū)氲剿酒贩N9311中,使得賴氨酸等必需氨基酸得到一定程度提高,改良了稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。本研究的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下：(1)隨著植株生長發(fā)育,不育系材料208S及其雜種浙優(yōu)3號中Cry1Ab/1Ac蛋白含量呈現(xiàn)逐步下降的趨勢；在葉片及莖稈中,Cry1Ab/1Ac蛋白的豐度要顯著高于其在胚乳及根部中的豐度；在所檢測的各個生長階段及不同組織中,Cry1Ab/1Ac蛋白的含量與其供體親本華恢1號(又名TT51)中的含量處于相同水平；cry1Ab/1Ac基因在不同遺傳背景下均可以穩(wěn)定表達(dá),同時其在純合及雜合狀態(tài)下并沒有出現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)。(2) Southern blot轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)檢測顯示,208S及其雜種后代浙優(yōu)3號、浙優(yōu)5號及02567同供體親本TT51一樣,均為中cry1Ab/1Ac基因雙拷貝材料。(3)不育系材料208S配組的三個材料產(chǎn)量均表現(xiàn)良好,其中浙優(yōu)3號及浙優(yōu)5號優(yōu)于南方稻區(qū)的主栽品種豐兩優(yōu)4號；208S及浙優(yōu)3號的絕大多數(shù)品質(zhì)性狀均達(dá)到或超過國標(biāo)優(yōu)質(zhì)米一級標(biāo)準(zhǔn)。(4)利用MAS及回交育種手段,將水稻材料華1517B中的抗稻瘟病基因Pi1、Pi2成功導(dǎo)入到不育系208S中,獲得了聚合Pi1、Pi2的改良材料。利用基因組中平均分布的并且在親本間(208S、華1517B)具有多態(tài)性的120個分子標(biāo)記,對改良株系進(jìn)行了遺傳背景回復(fù)情況分析。結(jié)果表明,通過雜交及三次的回交,待改良單株材料的背景回復(fù)率已經(jīng)達(dá)到96.7%,主要農(nóng)藝性狀與親本208S無顯著性差異。在育性方面,改良材料在夏季杭州表現(xiàn)出完全的不育狀態(tài),而在冬季海南則表現(xiàn)出部分可育狀態(tài),與親本208S表現(xiàn)一致,同時該材料主要農(nóng)藝性狀也與親本208S無顯著差異。(5) 改良稻瘟病抗性的株系在湖北省恩施市國家稻瘟病鑒定點(diǎn)表現(xiàn)為4級中度抗性,顯著的優(yōu)于親本對照208S(7級)；改良稻瘟病抗性株系在海南三亞試驗田表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟表現(xiàn)出完全的抗性,并與親本對照208S的抗蟲表現(xiàn)一致。(6) 定量qRT-PCR檢測LRP基因的表達(dá)模式后發(fā)現(xiàn),LRP基因在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的表達(dá)量極低；隨著灌漿時間的增加,胚乳中LRP基因的表達(dá)量急劇增加,說明LRP基因在PA110不同組織中表達(dá)量的變化情況與其Gtl啟動子的表達(dá)模式一致。在PA110胚乳中,外源的LRP基因?qū)φ麄�天冬氨酸代謝途徑相關(guān)酶基因均產(chǎn)生了一定影響；結(jié)果同時顯示,PA110胚乳中賴氨酸分解代謝的減少,可能導(dǎo)致總的賴氨酸含量較對照顯著的增加；對9個水稻種子貯藏蛋白相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析后發(fā)現(xiàn),這些基因的表達(dá)量隨著胚乳的發(fā)育呈現(xiàn)上升表達(dá)趨勢,但是在PA110中,這些基因表達(dá)量的上升幅度并沒有在對照品種中上升的幅度大。(7)在PA110種子中,包括賴氨酸在內(nèi)的幾乎所有氨基酸含量較對照均有一定程度提升,其中賴氨酸含量在糙米和精米中較對照分別提升了30.1%和28.0%,總氨基酸含量分別提升了21.3%和22.4%；在PA110葉片中,隨著植株的生長發(fā)育,各個游離氨基酸含量呈現(xiàn)上升趨勢；在成熟期,PA110中所有游離氨基酸含量均較對照有了明顯增加,其中賴氨酸增加幅度顯著。(8)在LRP基因?qū)氩牧?311LRP中后,賴氨酸含量較對照僅有7.3%的增加,而其它大部分氨基酸含量均有小幅度的降低,說明LRP基因在不同的遺傳背景條件下對提升賴氨酸的作用會有所差異；在PA110與9311的雜交衍生系中,糙米中的賴氨酸含量較雜種對照提升明顯(19.6%),而在PA64S與9311LRP的雜交衍生系中,糙米的賴氨酸含量較雜種對照出現(xiàn)了2.4%的降低,說明LRP基因在應(yīng)用到雜交水稻的過程中,其在不育系背景中的表現(xiàn)可能會比其在恢復(fù)系背景中更有應(yīng)用潛力；在PA110與9311LRP的雜交衍生系中,雖然LRP基因型為純合狀態(tài),然而在糙米中賴氨酸含量較雜種對照僅有9.2%的增加,說明LRP基因處于雜合狀態(tài)可能對提高雜種種子中賴氨酸含量更具應(yīng)用潛力。(9)轉(zhuǎn)基因材料PA110的株高與對照相比有著較明顯的降低,同時,PA110自交種子的千粒重及種子發(fā)芽率也較對照有著顯著的下降；對PA110成熟階段花粉進(jìn)行電鏡觀察后發(fā)現(xiàn),PA110中的外源LRP基因并未對不育系水稻的育性產(chǎn)生明顯影響；PAl 10衍生系9311LRP與對照9311在株高、每穗粒數(shù)、千粒重、種子萌發(fā)率等農(nóng)藝性狀方面存在一定負(fù)面效應(yīng),說明在9311背景下,種子胚乳中表達(dá)外源LRP基因可能會影響種子的灌漿充實度,并影響種子萌發(fā)；在雜交種PA110/9311(LRP雜合基因型)中,包括千粒重在內(nèi)的其他主要農(nóng)藝性狀均沒有發(fā)生顯著變化,說明雜種優(yōu)勢可能在一定程度上互補(bǔ)了PA110中農(nóng)藝性狀的負(fù)面效應(yīng)。然而PA64S/9311LRP(LRP雜合基因型)較對照表現(xiàn)出千粒重的顯著下降；LRP純合基因型的組合PA110/9311LRP也表現(xiàn)出千粒重較對照的顯著下降；以上結(jié)果表明,外源LRP基因在不同水稻遺傳背景下對水稻農(nóng)藝性狀的影響存在一定的差異；在不育系中適度表達(dá)LRP基因,并獲得的雜交品系在改良雜種賴氨酸含量方面更具有應(yīng)用的價值。(10)利用MAS結(jié)合傳統(tǒng)雜交的方法,獲得了聚合crylAc及LRP基因的改良材料9311LRP/crylAc;聚合材料表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟及二化螟良好的抗性,說明LRP基因并不會影響crylAc基因?qū)γx的抗性表現(xiàn)；但聚合材料種子中賴氨酸的含量顯著的低于在9311LRP中的含量,說明cry1Ac基因可能影響LRP基因發(fā)揮其在種子中積累賴氨酸的效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S511

【參考文獻(xiàn)】

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