本文關鍵詞：VP2互作蛋白CK1α及CSGalNAcT2在雞傳染性法氏囊病病毒復制中的作用及分子機制研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學院》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)引起的急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害3-6周齡雛雞的中樞免疫器官—法氏囊,有人形象地稱該病為雞的 艾滋病‖。隨著IBDV的不斷進化變異,先后出現(xiàn)了經(jīng)典毒株(classic IBDV,c IBDV)、變異毒株(variant IBDV,v IBDV)以及超強毒株(very virulent IBDV,vv IBDV),vv IBDV的高致死率給世界養(yǎng)禽業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟損失。近年來,在流行病學研究不斷深入及反向遺傳學技術日趨成熟的基礎上,作為IBDV外層衣殼唯一組成成分的VP2蛋白,已被確認為是決定病毒毒力及細胞嗜性差異的重要分子基礎。然而IBD發(fā)生與發(fā)展的實質(zhì)是IBDV與宿主細胞相互博弈的過程。盡管在病毒層面已表明VP2蛋白對IBDV的細胞嗜性和毒力有重要影響,然而VP2蛋白在宿主細胞內(nèi)的具體作用依然還不清楚。因此,深入了解VP2蛋白與宿主細胞的相互作用已成為目前揭開IBDV致病和免疫機制的研究重點。本研究從病毒與宿主相互作用的角度,采用不同的蛋白相互作用技術,以VP2蛋白為誘餌篩選出與其相互作用的宿主蛋白,并進一步探索它們在IBDV復制過程中的分子作用機制。首先,以免疫共沉淀技術與質(zhì)譜技術相結(jié)合,在感染IBDV的易感細胞DF1中,利用VP2蛋白的特異性單克隆抗體,鑒定出了一個互作候選蛋白酪蛋白激酶CK1α。免疫共沉淀及激光共聚焦試驗進一步證實,CK1α與VP2在IBDV感染過程中存在相互作用。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)在IBDV復制過程中,CK1α呈下調(diào)表達�；虮磉_調(diào)控實驗表明,CK1α下調(diào)表達能夠抑制IBDV復制,反之則促進IBDV復制,另外CK1α激酶活性抑制劑D4476也會抑制IBDV復制,這表明CK1α對IBDV復制的影響與其激酶活性有關。綜上,CK1α在IBDV復制過程中的下調(diào)表達可能是宿主抵抗IBDV的一種抗病毒應答。為深入揭示宿主通過下調(diào)CK1α來限制IBDV復制的分子機制,我們經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn),IBDV感染能夠誘導產(chǎn)生IFN-β,而CK1α過表達能夠拮抗IFN-β的抗病毒效應,但這種拮抗作用不是源于對IFN-β本身表達量的負調(diào)控,而是源于對IFNAR1穩(wěn)定性的負調(diào)控。CK1α負調(diào)控IFNAR1穩(wěn)定性的具體機制是,CK1α能夠泛素化降解IFNAR1。IFNAR1的C端胞內(nèi)區(qū)存在一個保守的降解決定子序列,它與IFNAR1的泛素化密切相關,其磷酸化位點S545是CK1α發(fā)揮調(diào)控功能的關鍵位點。點突變實驗證實,S545A的確能夠削弱CK1α介導的IFNAR1泛素化。IBDV感染宿主細胞的過程中,在發(fā)現(xiàn)CK1α下調(diào)的同時,也發(fā)現(xiàn)了IFNAR1在細胞膜表面上的分布增加。因此我們認為,CK1α作為宿主的一種感應分子,在IBDV感染后被下調(diào),進而通過負調(diào)控機制導致IFNAR1的上調(diào),從而增強宿主限制IBDV復制的能力。在宿主的抗病毒壓力下,病毒也進化出多種機制來利用宿主細胞的資源而利于自身復制。本研究還鑒定了另一個有利于IBDV復制的宿主細胞蛋白——高爾基體膜蛋白硫酸軟骨素N-乙酰氨半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶(CSGal NAc T2)。CSGal NAc T2能夠與VP2蛋白在高爾基體上發(fā)生相互作用。結(jié)合基因芯片分析結(jié)果及熒光定量檢測結(jié)果,我們證實,CSGal NAc T2在IBDV感染過程中表達上調(diào),而CSGal NAc T2上調(diào)表達能夠促進IBDV的復制,且此種促進作用依賴于高爾基體結(jié)構的完整性。高爾基體是IBDV“復制工廠”核糖核蛋白復合體(RNP)的所在地,VP2與CSGal NAc T2的相互作用進一步表明,IBDV能夠利用宿主蛋白CSGal NAc T2招募VP2到高爾基體從而利于自身的組裝和增殖。本研究首次發(fā)現(xiàn)了不同宿主蛋白與IBDV衣殼蛋白VP2互作所觸發(fā)的宿主細胞對病毒復制不同的調(diào)控效應,揭示了在IBDV感染過程中CK1α觸發(fā)的抗病毒機制,以及CSGal NAc T2介導的促進病毒復制的分子機理,對于深入認知IBDV的致病和免疫機制具有重要意義。
[Abstract]:Infectious Bursal Disease (IBD) is an acute and highly contagious infectious disease caused by infectious bursal disease virus (Infectious Bursal Disease Virus, IBDV). The disease mainly affects 3-6 week old chicks - central immune organs of IBD, people call the "chicken for AIDS disease. With the continuous evolution of IBDV, has appeared in the classical strains (classic IBDV, C, IBDV) (variant IBDV, V variant strain IBDV (very virulent) and vvIBDV IBDV, VV IBDV VV IBDV), the high mortality rate for the poultry industry in the world with huge economic losses. In recent years, based on the deepening of epidemiological research and the mature technology of reverse genetics, the VP2 protein as the sole component of outer capsid of IBDV has been identified as an important molecular basis for determining the virulence and cell tropism of viruses. However, the essence of the occurrence and development of IBD is the process of mutual game between IBDV and host cells. Although VP2 has been shown to play an important role in the cell tropism and virulence of IBDV, the specific role of VP2 protein in host cells is still unclear. Therefore, understanding the interaction of VP2 protein and host cell has become the focus of research on the pathogenesis and immune mechanism of IBDV. From the point of view of the interaction between virus and host, we used different protein interaction technologies to screen the host proteins interacting with VP2 protein, and further explored their molecular mechanism in the process of IBDV replication. First, combined immunoprecipitation and mass spectrometry, we identified an interaction protein casein kinase CK1 alpha in the susceptible cell DF1 infected with IBDV by using the specific monoclonal antibody of VP2 protein. Immunoprecipitation and laser confocal test further confirmed that CK1 alpha and VP2 interact in the process of IBDV infection. At the same time, we found that in the process of IBDV replication, the expression of CK1 alpha was downregulated. Gene expression regulation experiments showed that the down regulated expression of CK1 alpha could inhibit the replication of IBDV, whereas on the contrary, it promoted IBDV replication. Moreover, CK1 alpha kinase inhibitor D4476 also inhibited IBDV replication, indicating that the effect of CK1 on IBDV replication was related to its kinase activity. To sum up, the downregulation of CK1 alpha during IBDV replication may be an antiviral response of the host against IBDV. In order to further reveal the molecular mechanism of the host to limit IBDV replication through down-regulation of CK1 alpha, we have to explore found that IBDV infection could induce IFN- beta, CK1 alpha overexpression can antagonize the effect of antiviral IFN- beta, but this antagonism is not due to negatively regulate the expression amount of IFN- beta itself, but from the negative regulation on the stability of IFNAR1. The specific mechanism of CK1 alpha negatively regulates the stability of IFNAR1 is that CK1 alpha can degrade IFNAR1 by ubiquitination. There is a conserved degradation determining subsequence in the C terminal intracellular region of IFNAR1, which is closely related to ubiquitination of IFNAR1. Its phosphorylation site S545 is the key locus for CK1 alpha to exert regulatory function. The point mutation test confirmed that S545A could indeed weaken the CK1 - mediated IFNAR1 ubiquitination. In the process of IBDV infection of the host cells, the decrease of CK1 alpha was found, and the increase in the distribution of IFNAR1 on the surface of the cell membrane was also found. Therefore, we believe that CK1 alpha is an inducer of the host, which is down regulated after IBDV infection, and then leads to IFNAR1 up regulation by negative regulation mechanism, thereby enhancing the host's ability to limit IBDV replication. Under the anti-virus pressure of the host, the virus also evolved a variety of mechanisms to make use of the resources of the host cell to facilitate its own replication. Another N- cell membrane protein, chondroitin sulfate N-, acetylated Galacto transferase (CSGal NAc T2), which is favorable for IBDV replication, has been identified. CSGal NAc T2 can interact with the VP2 protein in the Golgi body. Combined with gene chip analysis and fluorescence quantitative detection results, we confirmed that CSGal NAc T2 expression was upregulated during IBDV infection, while CSGal NAc T2 up-regulated expression could promote IBDV replication, and this promotion effect was dependent on the integrity of Golgi body structure. The Golgi apparatus is the location of IBDV replication factory ribonuclein complex (RNP). The interaction between VP2 and CSGal NAc T2 further indicates that IBDV can recruit VP2 to Golgi body by CSGal NAc T2, enabling itself to assemble and proliferate. This is the first study found that different host proteins and IBDV capsid protein VP2 interaction triggered by the host cell replication regulation different effects on virus, reveals the antiviral mechanism of triggering CK1 alpha in the process of IBDV infection, and promote viral replication CSGal NAc T2 mediated molecular mechanism has important significance for in-depth understanding of IBDV the pathogenic and immune mechanism.
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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