本文關(guān)鍵詞：玉米和大豆根內(nèi)生細(xì)菌多樣性及促生細(xì)菌鑒定評價(jià)　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在不同植物器官內(nèi)分布數(shù)量存在差異,其中,根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它部位,具有寄主植物多樣性和種屬多樣性特征,且群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素影響。本研究以中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所水土保持監(jiān)測研究站在黑龍江省海倫市光榮村建立的玉米(Zea mays cv.,新墾5號(hào))和大豆(Glycine max cv.,東生1號(hào))輪作的長期定位試驗(yàn)地為平臺(tái),研究對象為不同施肥方式與不同侵蝕條件下大豆和玉米根內(nèi)生細(xì)菌,采用Locked Nucleic Acid(LNA)oligonucleotide-PCR Clamping(LNAPCR)和454高通量測序方法,比較黑土區(qū)大豆和玉米根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異;探討在表層土壤剝離條件下,施肥方式對根內(nèi)生細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響,揭示作物種類、土壤侵蝕和施肥管理與根內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)系,并建立了一種基于LNA-PCR和454高通量測序技術(shù)研究內(nèi)生細(xì)菌多樣性的新方法,同時(shí)采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)手段篩選植物內(nèi)生促生細(xì)菌,研究其促生效果,為促生菌種資源開發(fā)提供材料。主要研究結(jié)果如下:(1)采用LNA寡核苷酸引物對玉米和大豆根內(nèi)生細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以未加LNA寡核苷酸為對照,454高通量測序結(jié)果顯示,采用LNA擴(kuò)增的植物樣品中測得的基因序列基本上來源于內(nèi)生細(xì)菌,而在玉米和大豆中,未采用LNA的樣品測序結(jié)果中來源于植物細(xì)胞器的序列所占比例分別達(dá)97.4%和67.8%;并且,采用LNA擴(kuò)增的樣品比未加LNA擴(kuò)增的樣品具有較高的OTU數(shù)量、ACE、Chao1和Shannon指數(shù)及較低的Simpson指數(shù),表明采用LNA擴(kuò)增的樣品內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性較高,改進(jìn)了植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究方法。(2)采用LNA-PCR和454高通量測序方法比較大豆和玉米根內(nèi)生細(xì)菌多樣性差異,研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和黃桿菌屬(Flavobacterium)是大豆內(nèi)生細(xì)菌的主要成員,而鏈霉菌屬(Streptomyces)和Niastella是玉米內(nèi)生細(xì)菌的主要成員,結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)一些數(shù)目較少和不可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌,進(jìn)一步說明大豆和玉米根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性豐富。(3)采用LNA-PCR和454高通量測序方法分析土壤表層剝離30cm和施用有機(jī)肥的玉米苗期根內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),并以表層土未剝離和單施化肥處理為對照。結(jié)果共獲得37820條16S r RNA有效序列,主要分布在4個(gè)門,35個(gè)綱,214個(gè)屬和782個(gè)OTU,其中,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢菌門,但不同樣品中分布比例存在差異。內(nèi)生細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn),土壤侵蝕降低了玉米苗期根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性,但在表層黑土剝離和未剝離條件下,增施有機(jī)肥均可以增加根內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性,這種作用以表層土剝離30 cm處理表現(xiàn)得更為突出。(4)采用傳統(tǒng)梯度稀釋平板分離法測定不同土壤剝離、施肥方式及采樣時(shí)期下大豆和玉米根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量,結(jié)果表明,1/10 NA 30°C培養(yǎng)7 d后,不同樣品根內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量不同,在0.79×104~(-1)9.95×104 CFU g~(-1)·fresh·weight之間,并發(fā)現(xiàn)在大豆和玉米根內(nèi),7月10日樣品可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均明顯高于6月22日和8月24日樣品,大部分剝離樣品內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量小于相同施肥條件下的未剝離樣品。(5)采用可培養(yǎng)方法分別從大豆和玉米根部獲得119株和277株內(nèi)生細(xì)菌,發(fā)現(xiàn)其中39.6%的內(nèi)生細(xì)菌具有分泌IAA能力,分泌能力在1-23 mg·L~(-1)之間,對其中分泌IAA能力大于10 mg·L~(-1)的14株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S r RNA基因鑒定和潛在促生能力評價(jià)。16S r RNA基因鑒定結(jié)果證實(shí)14株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于嗜冷芽孢桿菌屬(Psychrobacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus),盆栽回接試驗(yàn)證實(shí)大部分菌株具有促生能力但促生效果不同,其中,菌株C4和C9(分別屬于Microbacterium和Lysinibacillus)對大豆和小麥的促生效果較好。(6)采用平板對峙培養(yǎng)法,從獲得的396株內(nèi)生細(xì)菌中篩選出12株具有拮抗作用的細(xì)菌,對大豆立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)表現(xiàn)出明顯拮抗作用,抑菌圈半徑在1.4 cm-3.5 cm之間。這12株內(nèi)生細(xì)菌對黃瓜尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)和番茄枯萎病菌(Fusarium oxgsporum f.sp.lycopersici)均具有拮抗作用,16S rRNA基因鑒定結(jié)果證實(shí)12株內(nèi)生拮抗細(xì)菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。選取5株進(jìn)行盆栽回接試驗(yàn),結(jié)果表明其均對大豆根腐病具有一定的防治效果,同時(shí)能夠促進(jìn)大豆幼苗生長。(7)研究發(fā)現(xiàn)分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌C9可能為一株潛在新種細(xì)菌,故采用多相分類學(xué)方法對其進(jìn)行分類地位確定。16S r RNA基因序列分析顯示菌株C9~T屬于賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus),與Lysinibacillus chungkukjangi NBRC 108948~T(序列相似性98.1%)和Lysinibacillus sinduriensis DSM 27595~T(序列相似性98.0%)的16S r RNA基因序列相似性最高,與Lysinibacillus sp.其它典型菌株相似性均低于98%。通過neighbour-joining、maximum-parsimony和maximum-likelihood 3種方法將菌株C9~T與Lysinibacillus sp.的典型菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)3種方法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致,菌株C9~T與Lysinibacillus sp.的各成員聚在一起。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、細(xì)胞化學(xué)組分分析及分子學(xué)鑒定確定菌株C9~T屬于Lysinibacillus sp.的一個(gè)新種,命名為Lysinibacillus endophyticus,典型菌株為C9~T,分別在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 1.15291~T)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM 100506~T)進(jìn)行保藏。
[Abstract]:Endophytic bacteria are an important part of micro ecosystem of plants, the number of differences, distribution in different plant organs in which the number of root endophytic bacteria far more than other parts, with host plant diversity and species diversity, community structure and environmental factors influence. In this study, China Academy of Sciences, Northeast Institute of geography and agricultural ecology study on Soil and water conservation monitoring station was established in the village of Helen glorious city of Heilongjiang province maize (Zea mays cv., the newly reclaimed 5) and soybean (Glycine Max cv., Dongsheng No. 1) long-term experiment for the rotation platform, the research object for different fertilization and under different erosion conditions of soybean and maize root endophytic bacteria, using Locked Nucleic Acid (LNA) oligonucleotide-PCR Clamping (LNAPCR) and 454 high throughput sequencing method, comparison of black soil area of soybean and maize root endophytic bacteria community structure difference; on the surface soil peeling conditions, fertilization effect on bacterial diversity and on the community structure of the root, to reveal the relationship between soil erosion and crop species, fertilization management and root endophytic bacteria, and the establishment of a research and LNA-PCR 454 high-throughput sequencing technology based on the diversity of Endophytic Bacteria The new method, at the same time, uses the traditional culture method to screen the endophytic bacteria of plant, study the effect of promoting the growth, and provide materials for the development of the resources for the growth of the bacteria. The main results are as follows: (1) using LNA DNA oligonucleotide primers for PCR amplification of endophytic bacteria in the roots of corn and soybeans, by not adding LNA oligonucleotide as control, 454 high throughput sequencing results showed that the gene sequence of LNA was measured in plant samples basically comes from endophytic bacteria in maize and in the soybean sequence without using the sequencing results of LNA samples in plant organelles accounted for 97.4% and 67.8% respectively; and amplified by LNA samples is higher than that without LNA amplification of the sample number of OTU, ACE, Chao1 and Shannon index and lower Simpson index showed that amplified by LNA samples of endophytic bacterial diversity is higher, improved the bacterial diversity of Endophytic method. (2) LNA-PCR and 454 using high-throughput sequencing methods of soybean and maize root endophytic bacterial diversity differences, the study found that Pseudomonas sp. (Pseudomonas), Bradyrhizobium sp. (Bradyrhizobium) and yellow (Flavobacterium) is the main member of Endophytic Bacteria of soybean, and Streptomyces (Streptomyces) and Niastella is the main member of Endophytic Bacteria in maize, also found some small number and non culturable endophytic bacteria results in further description of soybean and maize root endophytic bacteria community structure diversity. (3) LNA-PCR and 454 high flux sequencing method were used to analyze the endophytic bacterial community structure of maize root exfoliated 30cm and organic manure during the seedling stage. Results of the 37820 16S R RNA sequences were obtained, mainly distributed in 4 phyla, 35 classes, 214 genera and 782 OTU, among them, Proteobacteria (Proteobacteria), Firmicutes (Firmicutes), actinobacteria (Actinobacteria) and Bacteroidetes (Bacteroidetes) for advantage from gate, but there are differences in the distribution proportion in different samples. Endophytic bacteria community diversity index analysis showed that soil erosion reduced maize seedling root endophytic bacterial community diversity, but in black topsoil stripping and non stripping conditions, organic fertilizer can increase the root endophytic bacterial community diversity, the role in topsoil stripping of 30 cm more prominent. (4) using the traditional gradient dilution plate separation method for the determination of different soil stripping, fertilization methods and sampling period of soybean and maize root number, endophytic bacteria culture results showed that 1/10 NA 30 C after 7 d culture, different samples of root endophytic bacteria in different quantity, 0.79 * 9.95 * 104 104~ (-1) CFU g~ (-1) between fresh and weight, found in soybean and maize roots in July 10th, number of training samples can be endophytic bacteria were significantly higher than that in June 22nd and August 24th samples, most stripped samples of endophytic bacteria quantity is less than the same fertilization conditions without stripping samples. (5) the culture methods respectively from soybean and maize roots obtained 119 strains and 277 strains of endophytic bacteria, found that 39.6% endophytic bacteria can secrete IAA, Mg and L~ in 1-23 secretion (-1), the ability of secreting IAA more than 10 mg - L~ (-1) were evaluated by 16S r identification of RNA gene and potential growth promoting ability of endophytic bacteria in 14 strains. 16S r confirmed that RNA gene identification results of 14 strains of endophytic bacteria were psychrotrophic bacillus (Psychrobacillus), Microbacterium sp. (Microbacterium), lysine (Lysinibacillus) and Bacillus bacillus (Bacillus), pot inoculation experiment confirmed that most strains with growth promoting ability but the growth promoting effect of different. Among them, the strains of C4 and C9 (belong to Microbacterium and Lysinibacillus) of soybean and wheat growth promoting effect. (6) using plate confrontation culture, 12 antagonistic bacteria were screened from 396 endophytic bacteria obtained, showing obvious antagonism against Rhizoctonia solani, and the radius of inhibition zone is between 1.4 cm-3.5 cm. The 12 strains of endophytic bacteria on Cucumber Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum) and Fusarium oxysporum (Fusarium oxgsporum f.sp.lycopersici) has antagonistic effect, 16S rRNA confirmed that the gene identification results of 12 strains of endophytic bacteria belonging to the genus Bacillus (Bacillus), Bacillus (Paenibacillus) and Pseudomonas (Pseudomonas). 5 plants were selected for pot grafting test, the results showed that all of them had certain control effect on soybean root rot disease, and could promote the growth of soybean seedlings. (7) the study found that the secretion of IAA endophytic bacteria C9 may be a potential new species of bacteria, so the classification status of the bacteria was determined by multiphase taxonomy. 16S R
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513;S565.1

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本文編號(hào)：1342727