本文關(guān)鍵詞：基于Label free蛋白質(zhì)組學(xué)和LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)的四君子湯干預(yù)脾虛證機(jī)制研究　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：脾虛證是中(獸)醫(yī)臨床常見證候,主要以消瘦,倦怠,懶動(dòng),神疲和消化不良為主要癥狀。傳統(tǒng)中(獸)醫(yī)對其有較好的治療作用,但有關(guān)脾虛證過程蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究較少,對其現(xiàn)代科學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)不甚清楚。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草等四味中藥組成,是中(獸)醫(yī)臨床用于治療脾虛證的經(jīng)典名方,如何用現(xiàn)代語言闡釋中(獸)藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制一直是研究的難點(diǎn)。本論文采用利血平法復(fù)制脾虛證大鼠模型,首先通過藥效學(xué)研究評(píng)估四君子湯對脾虛證的干預(yù)效果。然后采用非標(biāo)記定量(Label free)蛋白質(zhì)組學(xué)和液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-Q-TOF-MS)代謝組學(xué)方法,對比研究脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證大鼠肝臟差異表達(dá)蛋白譜和血漿、肝臟差異代謝物譜,篩選出脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白和差異代謝物,最后采用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)蛋白和差異代謝物分別進(jìn)行分析,挖掘脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證可能的靶標(biāo)蛋白和潛在生物標(biāo)志物,并建立相應(yīng)的生物分子代謝通路和相互作用網(wǎng)絡(luò)。從蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)層面揭示四君子湯干預(yù)脾虛證的作用機(jī)制,以期為有效地指導(dǎo)脾虛證的臨床診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。本研究的具體內(nèi)容和結(jié)果如下:1.四君子湯干預(yù)脾虛證的藥效學(xué)研究40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組)、模型組(M組)、四君子湯干預(yù)組(SJZD組)和陽性對照組(PC組),采用利血平法復(fù)制脾虛證大鼠模型,觀察大鼠的臨床體征變化,檢測臟器指數(shù)、生理生化指標(biāo),行為學(xué)指標(biāo),并對胃、十二指腸、脾臟、肝臟等組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果表明,與正常對照組相比,模型組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、琥珀酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、胃蛋白酶、肝臟琥珀酸脫氫酶、肝臟Ca2+Mg2+-ATP酶、Na+K+-ATP酶等酶活性和血清及胃中胃泌素、饑餓素等含量均明顯下降(P0.05),而血清和肝臟中乳酸脫氫酶活性均明顯上升(P0.05)。與模型組相比,四君子湯干預(yù)組和陽性對照組上述指標(biāo)的活性和含量分別顯著回升或下降(P0.05)。曠場實(shí)驗(yàn)顯示,與正常對照組相比,模型組大鼠水平爬行格數(shù)和直立次數(shù)均極顯著降低(P0.01),與模型組相比,四君子湯干預(yù)組和陽性對照組大鼠水平爬行格數(shù)和直立次數(shù)均極顯著升高(P0.01)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組大鼠胃、十二指腸、脾臟、肝臟等組織均有不同程度的病理改變,與模型組相比,四君子湯干預(yù)組和陽性對照組大鼠上述組織的病理改變明顯減輕或恢復(fù)正常。以上結(jié)果提示:四君子湯對大鼠脾虛證具有較明顯的干預(yù)效果。2.肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究采用Label free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析各組模型大鼠肝臟組織蛋白表達(dá)譜的變化并按差異倍數(shù)1.5(0.67),篩選脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白,并對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋和富集、Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes(KEGG)注釋和富集及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示,篩選出脾虛證的差異表達(dá)蛋白267個(gè)(上調(diào)125個(gè),下調(diào)142個(gè)),四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白247個(gè)(上調(diào)81個(gè),下調(diào)166個(gè))。GO富集分析表明,脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和胞外區(qū)部分;主要參與各種代謝過程;脾虛證的差異表達(dá)蛋白主要功能體現(xiàn)在結(jié)合活性和酶活性方面,四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白主要分子功能為酶催化,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移方面。通過對比分析KEGG富集到的脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證的差異表達(dá)蛋白參與的靶標(biāo)路徑,表明四君子湯干預(yù)大鼠脾虛證的機(jī)制主要是通過對膽汁酸分泌、苯丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝等4條代謝通路的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示差異表達(dá)蛋白參與多種生物學(xué)功能和代謝通路,與GO注釋和KEGG注釋結(jié)果相一致。3.血清和肝臟代謝組學(xué)研究采用LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)獲得血清和肝臟組織的代謝輪廓,采用模式識(shí)別等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析,篩選模型大鼠血清及肝臟組織差異代謝物,并對差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性、熱圖、代謝通路和代謝物相互作用網(wǎng)路分析。結(jié)果顯示,模型組和正常對照組大鼠代謝輪廓完全分離,而四君子湯干預(yù)組和陽性對照組均向正常對照組靠近。根據(jù)VIP1.0和P0.05雙重指標(biāo)篩選出脾虛證潛在生物標(biāo)志物66個(gè)(血漿20個(gè),肝臟46個(gè)),四君子湯干預(yù)脾虛證潛在生物標(biāo)志物81個(gè)(血漿34個(gè),肝臟47個(gè))。采用Met PA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建潛在生物標(biāo)志物參與的代謝通路,選擇Impact0.10的代謝通路為靶標(biāo)通路,通過對比分析脾虛證和四君子湯干預(yù)脾虛證的潛在生物標(biāo)志物參與的靶標(biāo)通路,表明四君子湯干預(yù)大鼠脾虛證的機(jī)制主要是通過對甘油磷脂代謝、脂肪酸在線粒體中的延長、酮體的合成和降解、脂肪酸代謝、醚脂代謝、萜類物質(zhì)骨架合成、纈氨酸,亮氨和異亮氨酸降解、丁酸甲酯代謝等8條代謝通路的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。構(gòu)建了潛在生物標(biāo)志物的相互作用網(wǎng)絡(luò),篩選出了Acetyl-Co A,3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A和Hexanoyl-Co A等3個(gè)與四君子湯干預(yù)大鼠脾虛證相關(guān)性極強(qiáng)的潛在生物標(biāo)志物。綜上所述,健脾益氣基礎(chǔ)方四君子湯可不同程度的減緩脾虛證模型大鼠臨床癥狀,改善失調(diào)的生理生化指標(biāo)和組織器官的病理變化。蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究揭示,四君子湯分別通過膽汁酸分泌、苯丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝等和甘油磷脂代謝、脂肪酸在線粒體中的延長、酮體的合成和降解、脂肪酸代謝、醚脂代謝、萜類物質(zhì)骨架合成、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸降解、丁酸甲酯代謝等代謝通路,多靶點(diǎn)對大鼠脾虛證進(jìn)行干預(yù)。主要涉及到機(jī)體內(nèi)的脂代謝、氨基酸代謝、糖代謝等主要營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程,其中脂肪酸代謝為四君子湯主要的靶代謝途徑。本研究為脾虛證實(shí)質(zhì)的揭示和四君子湯干預(yù)脾虛證機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S853.7
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本文編號(hào)：1336106