本文關(guān)鍵詞：Gsdf和Wt1在羅非魚(yú)性別分化和性腺發(fā)育中的功能研究　出處：《西南大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：許多養(yǎng)殖魚(yú)類生長(zhǎng)具有明顯的性別二態(tài)性,性控育種技術(shù)是水產(chǎn)養(yǎng)殖增加產(chǎn)量和提高效率的有效途徑。尼羅羅非魚(yú)雄魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)快,全雄養(yǎng)殖還可避免過(guò)度繁殖,因此,單性化養(yǎng)殖是羅非魚(yú)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。尼羅羅非魚(yú)是一種世界性的養(yǎng)殖魚(yú)類,性別受到單基因決定,具有XX/XY性別決定系統(tǒng),人們提出遺傳全雄羅非魚(yú)(genetic male tilapia,GMT)技術(shù)控制性別,即采用YY超雄羅非魚(yú)與正常XX個(gè)體交配繁殖全雄XY魚(yú),但是至今這個(gè)技術(shù)還沒(méi)有在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣,難點(diǎn)在于YY維持系的建立,YY雌魚(yú)誘導(dǎo)難度大,需要更高的雌激素處理濃度和更長(zhǎng)的處理時(shí)間,即便獲得YY雌魚(yú)其育性也很低,本實(shí)驗(yàn)室獲得的YY雌魚(yú)甚至不育,目前亟須圍繞這個(gè)問(wèn)題開(kāi)展羅非魚(yú)性別決定與分化的分子機(jī)制研究,為最終實(shí)現(xiàn)其遺傳性別控制的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)方法。gsdf是魚(yú)類特有的TGF-?家族成員基因,在魚(yú)類精巢高表達(dá),最近在青溕中的研究表明它在精巢分化中具有重要作用。Wt1在哺乳類參與雄性別決定與分化,而在魚(yú)類中的功能不是很清楚。而魚(yú)類由于魚(yú)類特有的基因組的復(fù)制(3R)具有2個(gè)亞型:wt1a和wt1b。本研究通過(guò)CRISPR/Cas9建立了羅非魚(yú)gsdf和wt1敲除系,并對(duì)敲除系進(jìn)行分析,研究gsdf和wt1在性別分化和性腺發(fā)育中的作用,并在ZX奧尼雜交雄性羅非魚(yú)(尼羅羅非魚(yú)XX♀×奧利亞羅非魚(yú)ZZ♂)中敲除gsdf研究其在魚(yú)類性別分化中功能是否保守,主要研究結(jié)果如下:1、在本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)CRISPR/Cas9在尼羅羅非魚(yú)敲除gsdf獲得F0代陽(yáng)性魚(yú)的基礎(chǔ)上,采用F0代陽(yáng)性魚(yú)開(kāi)展gsdf基因純合敲除建系,分析了F0代XY嵌合體敲除率與性腺表型的關(guān)系,以及gsdf敲除的F1代雜合子和F2代純合子的表型。發(fā)現(xiàn)敲除率"g58%的XY性腺在90 dah(days after hatching,孵化后天數(shù))時(shí)發(fā)育為卵精巢,在180和240 dah時(shí)完全逆轉(zhuǎn)為卵巢,敲除率58%的XY性腺發(fā)育為正常精巢,F1代XYgsdf+/-性腺都發(fā)育為精巢,而F2代XY gsdf-/-性腺都發(fā)育為卵巢。通過(guò)F1代XY gsdf+/-與F0代性逆轉(zhuǎn)的XY雌魚(yú)回交,獲得了YY gsdf-/-,60dah時(shí)通過(guò)組織學(xué)觀察顯示它們都發(fā)育為卵巢。說(shuō)明gsdf是尼羅羅非魚(yú)雄性性別分化所必需的基因,且在雄性性別分化過(guò)程中g(shù)sdf的需求有一定閾值。2、免疫組化檢測(cè)純合突變性腺分化早期的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn):xygsdf-/-性腺在10dah雄性通路已經(jīng)開(kāi)啟,表達(dá)dmrt1,然后在18dah,雌雄通路都開(kāi)啟,同時(shí)表達(dá)dmrt1和cyp19a1a,在孵化后36天,關(guān)閉了雄性通路,僅開(kāi)啟雌性通路,只表達(dá)cyp19a1a,并出現(xiàn)i時(shí)相的卵母細(xì)胞,完成了由雄向雌的性逆轉(zhuǎn),表明在沒(méi)有g(shù)sdf的情況下,xy性腺可開(kāi)啟雄性信號(hào)通路,表達(dá)dmrt1,但不能夠維持。通過(guò)對(duì)正常xy性腺鄰近切片免疫組化分析發(fā)現(xiàn)4dah時(shí)gsdf和dmrt1均沒(méi)有表達(dá),而在5dah之后,gsdf和dmrt1共表達(dá)于性腺的支持細(xì)胞。對(duì)gsdf啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)上面具有一個(gè)dmrt1的結(jié)合位點(diǎn)。在hek293細(xì)胞中進(jìn)行g(shù)sdf啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)dmrt1單獨(dú)轉(zhuǎn)染不能激活gsdf的轉(zhuǎn)錄,當(dāng)與sf1共轉(zhuǎn)染時(shí)dmrt1能夠劑量依賴地增強(qiáng)sf1激活的gsdf轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明在尼羅羅非魚(yú)雄性性別決定通路中g(shù)sdf是dmrt1的下游靶基因。3、通過(guò)real-timepcr檢測(cè)90dahgsdf-/-性腺基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)促進(jìn)雌激素合成酶cyp19a1a表達(dá)的基因foxl2在xygsdf-/-個(gè)體的表達(dá)水平顯著高于正常的xygsdf+/+個(gè)體,而與xxgsdf+/+和gsdf-/-個(gè)體差異不顯著,雄激素合成酶cyp11b2在xygsdf-/-個(gè)體的表達(dá)水平顯著低于正常的xygsdf+/+個(gè)體,而與xxgsdf+/+和gsdf-/-個(gè)體差異不顯著,血清雌激素(e2,17β-estradiol)和雄激素(11-kt,11-ketotestosterone)水平檢測(cè)得到與此相一致的結(jié)果。通過(guò)芳香化酶抑制劑(aromataseinhibitor,ai)投喂處理xygsdf-/-個(gè)體,處理時(shí)間從10到35dah,能夠回救敲除表型,性腺發(fā)育為精巢,表達(dá)dmrt1和cyp11b2,回救魚(yú)在180dah能產(chǎn)生正常精子,并能夠正常授精。表明gsdf可能通過(guò)下調(diào)雌激素的合成、上調(diào)雄激素的合成而促進(jìn)精巢的分化,但其涉及的分子機(jī)制有待闡明。4、引入奧利亞羅非魚(yú)培育建立純系和雜交系。將zz奧利亞雄魚(yú)與尼羅羅非魚(yú)xx雌魚(yú)交配,獲得了100%的zx雄性羅非魚(yú)。將zx雄魚(yú)與尼羅羅非魚(yú)xx回交,獲得了1:1的雌雄性比。將zw奧利亞雌魚(yú)與yy超雄尼羅羅非魚(yú)雜交,獲得了100%雄性后代。奧利亞zz雄魚(yú)與zw雌魚(yú)交配,獲得了1:1的雌雄比后代。采用fadrozole處理能將奧利亞zw雌魚(yú)逆轉(zhuǎn)為正常雄魚(yú),zw雄魚(yú)與尼羅xx雌魚(yú)雜交,獲得1:1的雌雄性比后代。將zw雄魚(yú)與zw雌交配,可以獲得3:1的雌雄性比。結(jié)合尼羅非魚(yú)xx為雌魚(yú),xy為雄魚(yú),以及奧利亞非魚(yú)zz為雄魚(yú),zw為雌魚(yú)的事實(shí),說(shuō)明了在尼羅和奧利亞羅非魚(yú)性染色體的性別控制能力由強(qiáng)到弱為:ywzx。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得了奧利亞羅非魚(yú)的gsdforf序列,發(fā)現(xiàn)其與尼羅羅非魚(yú)序列相似度達(dá)到99.5%。通過(guò)免疫組化研究了gsdf在zx全雄雜交羅非魚(yú)性腺的10dah表達(dá),發(fā)現(xiàn)zx性腺與xy性腺一樣高表達(dá)gsdf。進(jìn)一步在zx魚(yú)crispr/cas9敲除gsdf,近一半f0代陽(yáng)性魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為雌魚(yú),證明了gsdf在不同遺傳背景下保守的促進(jìn)雄性性別分化的功能。5、通過(guò)原位雜交研究了wt1a和wt1b的表達(dá)。在腎臟中,wt1a表達(dá)于3、5、20和40 dah腎小球中,而wt1b在3dah的腎小球中不表達(dá),5、20和40 dah都表達(dá)于腎小球中。在早期性腺中,wt1a和wt1b都表達(dá)于3和5 dah的性腺體細(xì)胞中;在成魚(yú)卵巢中,wt1a表達(dá)于顆粒細(xì)胞、鞘膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞,wt1b表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞;在成魚(yú)精巢中,wt1a表達(dá)于支持細(xì)胞,wt1b表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)CRISPR/Cas9敲除了wt1a和wt1b,并分別構(gòu)建了純合敲除系。wt1a-/-在6 dah時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重腹水,10 dah全部死亡,wt1b-/-不致死。進(jìn)一步組織切片觀察發(fā)現(xiàn)6 dah時(shí)wt1a-/-個(gè)體的腎臟中未見(jiàn)腎小球形成,wt1b-/-和對(duì)照的腎小球發(fā)育正常。wt1a在腎小球早期單獨(dú)表達(dá),可能對(duì)其發(fā)育至關(guān)重要,wt1b不能補(bǔ)償wt1a在腎臟早期發(fā)育中的功能。在180 dah對(duì)wt1b純合敲除的后代進(jìn)行分析:組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)XX wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的卵巢,XY wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的精巢;免疫組化分析顯示wt1b-/-的XX性腺表達(dá)Cyp19a1a,不表達(dá)Cyp11b2,wt1b-/-的XY性腺,表達(dá)Cyp11b2,不表達(dá)Cyp191a;血清激素水平顯示,wt1b-/-的XX個(gè)體E2和11-KT與對(duì)照XX(wt1b+/+和wt1b+/-)雌魚(yú)差異不顯著;XY wt1b-/-個(gè)體E2和11-KT對(duì)照XY(wt1b+/+和wt1b+/-)雄魚(yú)差異不顯著。wt1b-/-的雄性個(gè)體在180 dah時(shí)能產(chǎn)生精子,并能夠正常授精。wt1a純合敲除致死,其對(duì)性別決定的功能不得而知,而wt1b純合突變不會(huì)影響羅非魚(yú)存活和性別決定,wt1b在精巢發(fā)育中的功能冗余,在卵巢發(fā)育是否冗余需要進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述,gsdf純合敲除能夠?qū)е耎Y和YY魚(yú)性別逆轉(zhuǎn),證明是Gsdf在羅非魚(yú)雄性性別決定通路必需基因。也為建立羅非魚(yú)YY維持系提供了新的技術(shù)途徑。Dmrt1能在gsdf純合敲除后的XY性腺表達(dá),gsdf啟動(dòng)子具有Dmrt1結(jié)合位點(diǎn),且啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt1在Sf1存在的情況下能上調(diào)gsdf的轉(zhuǎn)錄,表明gsdf在羅非魚(yú)雄性性別通路中位于dmrt1的下游。gsdf可能是通過(guò)下調(diào)雌激素水平、上調(diào)雄激素水平來(lái)控制雄性性別的。與XY一樣,在ZX雜交魚(yú)中敲除gsdf同樣導(dǎo)致由雄向雌的性逆轉(zhuǎn),證明Gsdf在具有不同遺傳背景的羅非魚(yú)雄性性別分化中功能保守。wt1a純合敲除致死說(shuō)明wt1a對(duì)于羅非魚(yú)存活至關(guān)重要,且wt1b不能補(bǔ)償wt1a的功能。wt1a純合敲除致死,其對(duì)性別決定的功能不得而知,wt1b純合敲除不會(huì)影響羅非魚(yú)的性別表型,在成魚(yú)階段,wt1b的缺失不會(huì)影響羅非魚(yú)雄魚(yú)生殖功能,對(duì)雌魚(yú)生殖的影響有待進(jìn)一步證明。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
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本文編號(hào)：1333348