發(fā)布時(shí)間：2017-12-25 13:28

  本文關(guān)鍵詞：甘草酸合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中ABA關(guān)鍵功能基因NCEDs變異對(duì)甘草酸合成的影響研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：甘草作為常用大宗藥材,素有“國(guó)老”之稱(chēng),在國(guó)內(nèi)外均有很大用量。然而,隨著甘草野生資源的匱乏,栽培甘草已成主流商品的主要來(lái)源,但多數(shù)栽培甘草存在質(zhì)量下降問(wèn)題,其中以甘草酸最明顯,多數(shù)栽培甘草中的甘草酸含量達(dá)不到15版《中華人民共和國(guó)藥典》與16版《日本藥局方》規(guī)定的2.0%與2.5%的要求。這一問(wèn)題如不能突破,不僅影響其臨床療效,最終制約其出口遠(yuǎn)銷(xiāo),因此提高栽培甘草中甘草酸含量成為亟待解決的問(wèn)題。通過(guò)本課題組前期研究與查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)植物中次生代謝產(chǎn)物的合成途徑存在一個(gè)相互聯(lián)系相互影響的代謝網(wǎng)絡(luò)。因此本論文試圖從構(gòu)建促進(jìn)甘草酸合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)入手,篩選促進(jìn)甘草酸合成的內(nèi)源性調(diào)控物質(zhì),并從產(chǎn)量及關(guān)鍵功能基因表達(dá)兩方面解析該物質(zhì)促進(jìn)甘草酸合成的機(jī)制,進(jìn)而通過(guò)對(duì)不同種質(zhì)調(diào)控物質(zhì)含量變異的測(cè)定,分析不同種質(zhì)自然狀態(tài)下該物質(zhì)的含量狀況,通過(guò)調(diào)控該物質(zhì)合成的關(guān)鍵功能基因的多態(tài)性與調(diào)控物質(zhì)含量及甘草酸含量的相關(guān)性,解析該物質(zhì)及甘草酸含量差異形成的分子機(jī)制,為甘草及其他藥用植物優(yōu)良種質(zhì)的篩選提供依據(jù)。具體結(jié)果如下：1.通過(guò)外施不同濃度的6種激素篩選出促進(jìn)甘草酸合成的最佳調(diào)控物質(zhì)為ABA。在6月中旬(生長(zhǎng)初期)及7月中旬(生長(zhǎng)中期)對(duì)甘草噴施不同濃度ABA、GA、MeJa、 6-BA、BR及IAA,運(yùn)用HPLC測(cè)定7月、8月、9月及10月四個(gè)取樣時(shí)期甘草的甘草酸、甘草苷與其他5種黃酮類(lèi)(異甘草苷、芹糖基甘草苷、芹糖基異甘草苷、甘草素、異甘草素)成分的含量。結(jié)果表明：第一,6月中旬進(jìn)行的ABA各處理中對(duì)甘草酸、甘草苷促進(jìn)效果較好的處理濃度均為25mg/L,4個(gè)取樣時(shí)期甘草酸含量分別比對(duì)照高78.96%、52.28%、46.43%及52.01%,甘草苷含量分別比對(duì)照高25.61%、47.80%、101.62%及27.85%,差異均達(dá)顯著水平；7月中旬進(jìn)行的ABA各處理中對(duì)甘草酸促進(jìn)效果較好的處理濃度為50mg/L,對(duì)甘草苷促進(jìn)效果各濃度均弱于6月中旬；不同濃度ABA對(duì)甘草其他5種黃酮類(lèi)成分的含量影響差異均不顯著。第二,6月中旬進(jìn)行的6-BA各處理中對(duì)甘草酸、甘草苷促進(jìn)效果較好的處理濃度均為100mg/L,4個(gè)取樣時(shí)期甘草酸含量與對(duì)照差異達(dá)顯著水平；7月中旬進(jìn)行的6-BA各處理中對(duì)甘草酸、甘草苷促進(jìn)效果較好的處理濃度仍均為100mg/L,在3個(gè)取樣時(shí)期的甘草酸及甘草苷含量與對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平；不同濃度6-BA對(duì)甘草其他5種黃酮類(lèi)成分的含量影響差異均不顯著。第三,GA、MeJa、BR及IAA對(duì)甘草苷及甘草酸的影響效果均低于ABA及6-BA,且與對(duì)照差異不顯著；而對(duì)其他5種黃酮類(lèi)物質(zhì)的影響均不穩(wěn)定,且總體差異并不顯著。第四,通過(guò)整體評(píng)價(jià),在6種激素中,ABA處理效果最好,6-BA其次,這兩種激素不但能夠顯著提高甘草中甘草酸及甘草苷的含量,而對(duì)其他5種黃酮類(lèi)物質(zhì)總體影響表現(xiàn)為不顯著。第五,低濃度ABA對(duì)甘草7種成分有一定的促進(jìn)作用,高濃度ABA與之相反；0-50mg/L區(qū)間內(nèi),與甘草苷、異甘草苷及甘草酸呈極顯著正相關(guān)(P0.01),與芹糖異甘草苷呈顯著正相關(guān)(P0.05)；而在50-200mg/L區(qū)間時(shí),ABA同樣與所有7種成分出現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,并與甘草酸呈極顯著負(fù)相關(guān)(P0.01)。其他5種激素與甘草7種成分相關(guān)關(guān)系不一。因此,ABA是一種良好的促進(jìn)甘草酸合成的調(diào)控物質(zhì)。2.脫落酸(ABA)通過(guò)促進(jìn)β-AS基因的表達(dá)促進(jìn)甘草酸合成。以6月中旬(生長(zhǎng)初期)及7月中旬(生長(zhǎng)中期)噴施不同濃度ABA甘草樣品為材料,測(cè)定甘草植株的生長(zhǎng)及產(chǎn)量特征指標(biāo)；以不同濃度ABA處理的甘草種苗為材料,對(duì)β-AS的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明,第一,不同濃度ABA處理1年生甘草植株在處理初期對(duì)其生長(zhǎng)指標(biāo)產(chǎn)生不同程度影響。兩個(gè)處理時(shí)期第一次取樣時(shí),100mg/L及200mg/L ABA處理樣品的株高、地徑、根粗、根鮮重均低于對(duì)照,但這種阻礙作用隨處理甘草的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸消失。而25mg/L及50mg/L ABA處理甘草則對(duì)甘草生長(zhǎng)發(fā)育總體影響不顯著。第二,低濃度ABA處理均可以持續(xù)促進(jìn)β-AS的表達(dá),而高濃度ABA在處理時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)則會(huì)對(duì)其表達(dá)起阻礙作用。不同濃度ABA處理甘草幼苗,在3h及6h時(shí),所有處理均能促進(jìn)β-AS的表達(dá),與對(duì)照相比差異均達(dá)到顯著程度。但12h取樣時(shí),100mg/L及200mg/L ABA處理樣品的β-AS的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,至24時(shí),兩者相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照。3.甘草NCEDs基因家族成員的克隆及功能的初步驗(yàn)證。以整珠甘草幼苗為材料,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,克隆NCEDs基因家族成員：NCED1、NCED3、NCED4。結(jié)果表明,NCED1、NCED3及NCED4的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)分別為1830bp、1830bp及1764bp。3個(gè)基因均有一個(gè)外顯子,均不含內(nèi)含子。3個(gè)基因分別可以編碼609、609及587個(gè)氨基酸。其假定蛋白的分子量分別為67.56 kDa、67.29kDa及63.98kDa,等電點(diǎn)分別為6.64、5.95及6.26。利用PEG模擬干旱對(duì)甘草進(jìn)行處理可以促進(jìn)NCEDs3個(gè)基因的表達(dá),而且其表達(dá)與ABA含量的增加具有同步性,結(jié)合文獻(xiàn)可以初步確定我們克隆到的NCEDs就是甘草ABA合成的關(guān)鍵功能基因NCEDs。4.研究不同種源甘草中甘草酸等有效成分及激素類(lèi)物質(zhì)的變異。以采集過(guò)甘草葉樣對(duì)應(yīng)植株的根為材料,主根用于測(cè)定甘草酸、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素5種成分含量,根尖用于測(cè)定內(nèi)源6-BA、ABA、GA、MeJa及BR的含量。結(jié)果表明,第一,不同種源間甘草酸含量整體差異達(dá)顯著程度(P0.05),13個(gè)產(chǎn)地中甘草酸含量最高的種源來(lái)自山西應(yīng)縣,為2.29%,最低的來(lái)自甘肅民勤,為1.28%；不同種源內(nèi)甘草酸含量極差最大的種源來(lái)自?xún)?nèi)蒙古杭錦旗巴音烏素鎮(zhèn),其極差為2.95%,最小的來(lái)自?xún)?nèi)蒙古敖漢旗,其極差為0.98%,僅為最大極差的33.22%,說(shuō)明種源間及部分種源內(nèi)部均存在較豐富的變異。不同種源間甘草苷、異甘草苷及異甘草素含量整體差異達(dá)顯著水平,不同種源間甘草素含量總體差異不顯著。第二,不同種源間ABA含量整體差異達(dá)極顯著程度(P=0.0020.01)；13個(gè)種源中ABA極差大于100ng·g-1. FW的種源有4個(gè),小于100ng·g-1.FW大于40ng·g-1. FW的種源有8個(gè),小于40ng·g-1. FW的種源有1個(gè)。第三,不同種源間6-BA、MeJa及GA含量整體差異分別達(dá)極顯著、顯著、極顯著水平,BR差異未達(dá)顯著程度。5.在來(lái)自13個(gè)種源的樣品中克隆并測(cè)序成功3個(gè)基因的樣品數(shù)分別為65個(gè)、67個(gè)及36個(gè),分別發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的個(gè)數(shù)分別為14個(gè)、14個(gè)及29個(gè)。根據(jù)NCED1基因SNP位點(diǎn)的情況將樣品分為22個(gè)基因型；根據(jù)NCED3基因SNP位點(diǎn)的情況可將分為29個(gè)基因型；根據(jù)NCED4基因SNP位點(diǎn)的情況,可將樣品分為27個(gè)基因型。發(fā)現(xiàn)部分種源在多個(gè)基因型中均有分布,說(shuō)明種源內(nèi)部具有較豐富的變異；而有的基因型包含不同種源的樣品,說(shuō)明不同種源間又存在一致性的特點(diǎn)。6.甘草酸與脫落酸(ABA)含量變異的分子機(jī)制研究。以第六、七章實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行甘草NCEDs3個(gè)基因SNPs位點(diǎn)分別與脫落酸及甘草酸含量的灰色關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明,第一,NCED1基因、NCED3基因及NCED4基因所有SNP中與甘草酸含量關(guān)聯(lián)系數(shù)大于0.8的變異位點(diǎn)分別占相應(yīng)基因變異位點(diǎn)總個(gè)數(shù)的78.57%、76.92%及72.41%,說(shuō)明3個(gè)基因多數(shù)變異SNP位點(diǎn)對(duì)甘草酸合成與積累均具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。其中3個(gè)基因與甘草酸含量關(guān)聯(lián)系數(shù)最大的分別為NCED1基因437bp(GA),NCED3基因966bp(GA)及NCED4基因845bp(AG)。第二,NCED1基因所有變異位點(diǎn)中與ABA含量關(guān)聯(lián)系數(shù)大于0.8的變異位點(diǎn)占總變異位點(diǎn)的78.57%,而NCED3基因所有變異位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)系數(shù)均在0.8-0.7之間,NCED4所有變異位點(diǎn)中關(guān)聯(lián)系數(shù)大于0.7的個(gè)數(shù)占總變異位點(diǎn)數(shù)的68.97%。說(shuō)明3個(gè)基因中NCED1基因變異位點(diǎn)對(duì)本取樣時(shí)期ABA合成與積累總的作用要優(yōu)于其他兩個(gè)兩個(gè)基因,但其他兩個(gè)基因?qū)BA合成和積累也具有一定作用。綜上,在進(jìn)行高甘草酸種質(zhì)的篩選時(shí)應(yīng)該優(yōu)先考慮的變異位點(diǎn)為NCED1基因437bp處A型,NCED3基因966bp處A型及NCED4基因845bp處G型。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S567.71
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本文編號(hào)：1333027