本文關(guān)鍵詞：miR-26b調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：miRNAs是一種長度約為22-25nt的小非編碼RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miR-26b是目前研究較多的一個(gè)miRNA,廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和自噬等多種細(xì)胞過程的調(diào)控。在豬卵巢組織中,實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-26b在卵泡閉鎖過程中表達(dá)上調(diào),促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。目前豬miR-26b前體特征尚不清楚,其調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究也較少。本文通過克隆獲得了豬miR-26b前體序列,利用生物信息學(xué)方法分析了其序列與結(jié)構(gòu)特征;利用生物信息學(xué)方法預(yù)測和試驗(yàn)驗(yàn)證miR-26b在豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡中的作用;利用生物信息學(xué)方法和多種試驗(yàn)技術(shù)鑒定miR-26b的靶基因,并分析了 miR-26b調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,為解析miR-26b調(diào)控豬卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制提供依據(jù)。本文研究結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面:1、豬miR-26b前體的克隆和序列分析以豬基因組DNA為模板,通過擴(kuò)增測序獲得85bp豬miR-26b前體序列,同源性比對發(fā)現(xiàn)豬miR-26b前體序列與哺乳動(dòng)物其它物種高度保守。哺乳動(dòng)物miR-26b成熟序列高度一致,與斑馬魚和海七鰓鰻相比,也僅在11位核苷酸處出現(xiàn)U-C突變。脊椎動(dòng)物miR-26b種子序列均為UCAAGUA。RNAfold軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)豬miR-26b的二級(jí)結(jié)構(gòu)為典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu),另外還含有四個(gè)不對稱的突起,這可能與其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。研究結(jié)果表明哺乳動(dòng)物miR-26b高度保守,推測miR-26b的功能在哺乳動(dòng)物中具有相似性。miRNA主要通過靶基因發(fā)揮作用,KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)miR-26b的靶基因主要富集在凋亡、PI3K-Akt、FoxO和TGF-p等信號(hào)通路中,其中凋亡相關(guān)通路富集的靶基因最多,提示miR-26b可能是一個(gè)凋亡相關(guān)的miRNA。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在豬卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-26b后,顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增加,且可顯著抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),表明miR-26b可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,是豬卵泡顆粒細(xì)胞中的促凋亡因子。2、miR-26b通過靶向USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)USP9X是miR-26b的一個(gè)候選靶基因。熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)miR-26b顯著抑制USP9X-3'UTR熒光素酶載體活性,但對突變型USP9X-3'UTR熒光素酶載體活性無影響,表明miR-26b可與USP9X基因3'UTR直接結(jié)合并抑制USP9X的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞中過表達(dá)mi-26b可極顯著降低USP9X基因mRNA和蛋白水平,說明mi-26b可靶向抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞中USP9X的表達(dá)。敲減USP9X可極顯著增加豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率,顯著增加促凋亡基因Bax和降低抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平,說明USP9X可以抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。另外,將miR-26b inhibitor和USP9X-siRNA共轉(zhuǎn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增加,說明miR-26b可通過靶向抑制USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。前人研究發(fā)現(xiàn)Samd4是USP9X的下游基因,USP9X可通過去泛素化減少SMAD4蛋白的降解來增強(qiáng)其生物學(xué)功能。本文進(jìn)一步分析了 USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制。敲減USP9X后豬卵泡顆粒細(xì)胞中SMAD4基因mRNA表達(dá)水平無顯著變化,而SMAD4蛋白水平顯著降低,表明USP9X可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中SMAD4蛋白表達(dá)。過表達(dá)SMAD4可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)增殖,敲減SMAD4則可促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。而過表達(dá)或者抑制miR-26b,可分別顯著抑制或者促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中SMAD4的表達(dá),表明miR-26b可通過USP9X-SMAD4軸調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。同時(shí),TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的配體TGF-β1也參與了豬卵泡顆粒細(xì)胞中miR-26b-USP9X-SMAD4信號(hào)通路的調(diào)控。另外,我們發(fā)現(xiàn)在豬CYP19A1基因啟動(dòng)子區(qū)存在SBE(SMAD結(jié)合位點(diǎn)),熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn),過表達(dá)或者敲減SMAD4后可促進(jìn)或者抑制CYP19A1基因啟動(dòng)子活性。過表達(dá)SMAD4可促進(jìn)豬卵泡顆粒細(xì)胞中CYP19A1表達(dá)和雌激素合成。綜上所述,miR-26可通過靶向抑制USP9X-SMAD4-CYP19A1通路中USP9X調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的通路。3、miR-26b通過靶向HAS 2調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)miR-26b可通過靶向HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。本文首先利用生物信息學(xué)方法、點(diǎn)突變和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),進(jìn)一步證實(shí)miR-26b可與HAS2基因3'UTR直接結(jié)合抑制HAS2的表達(dá)。qRT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)HAS2基因mRNA和蛋白在豬健康卵泡中的表達(dá)水平分別顯著或極顯著高于閉鎖卵泡,表明HAS2可能參與了豬卵泡閉鎖的調(diào)控。敲減HAS2可顯著增加豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,而過表達(dá)HAS2則顯著降低豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,表明HAS2可抑制豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。另外,將miR-26b inhibitor和HAS2-siRNA共轉(zhuǎn)體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡顯著增加,說明miR-26b可通過靶向抑制HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。HAS2是HA合成的關(guān)鍵酶,而HA是通過激活CD44和抑制Caspase-3的表達(dá)來抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的。本文進(jìn)一步分析了 miR-26b通過HAS2調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的通路。敲減HAS2可極顯著降低豬卵泡顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中HA的濃度和CD44基因表達(dá),激活Caspase-3基因表達(dá),與抑制miR-26b對HA- CD44-Caspase-3通路的影響相反;敲減HAS2可抑制miR-26b inhibitor對HA- CD44-Caspase-3通路的調(diào)控,表明miR-26b可通過HAS2調(diào)控下游通路HA-CD44-Caspase-3。外源添加HA可顯著影響豬卵泡顆粒細(xì)胞中CD44和Caspase-3基因表達(dá),顯著降低顆粒細(xì)胞凋亡率,并可挽救HAS2-siRNA和miR-26b引起的顆粒細(xì)胞凋亡,說明miR-26b可通過HAS2-HA-CD44-Caspase-3通路來調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。綜上所述,本文獲得了豬miR-26b前體基因序列,進(jìn)一步證實(shí)其是豬卵泡顆粒細(xì)胞中的促凋亡因子。USP9X和HAS2是豬卵泡顆粒細(xì)胞中miR-26b的直接靶基因,miR-26b 可通過 USP9X-SMAD4-CYP19A1 信號(hào)通路和 HAS2-HA-CD44-Caspase-3 信號(hào)通路調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)凋亡。因此,本文發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的調(diào)控豬卵泡閉鎖和卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路:miR-26b-USP9X-SMAD4-CYP19A1通路和miR-26b-HAS2-CD44-Caspase-3 通路。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828.3

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本文編號(hào)：1332153