本文關(guān)鍵詞：PEDV病毒樣顆粒的構(gòu)建與免疫原性研究　出處：《石河子大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine Epizootic Diarrhea,PED)是豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epizootic Diarrhea Virus,PEDV)引起的新生仔豬的一種腸道傳染病。主要引起仔豬的急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水,導(dǎo)致新生仔豬死亡率高達(dá)80%-100%。一般不能引起成年豬死亡。該病在上世紀(jì)70年代首次在歐洲被發(fā)現(xiàn),后來(lái),在亞洲國(guó)家也多有發(fā)生,2013年首次在美國(guó)爆發(fā)。是近年來(lái)對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成影響最大的傳染病之一。由于該病毒又出現(xiàn)新的變異株,致使經(jīng)典的疫苗株制備的弱毒疫苗和滅活疫苗已不能很好地保護(hù)新生仔豬的感染和死亡。所以急需研制一種新型的PEDV疫苗來(lái)應(yīng)對(duì)PEDV的爆發(fā)。病毒樣顆粒(Virus-like Particles,VLPs)是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白組裝形成的空心的病毒外殼。其不含病毒核酸,安全性高;其保持真實(shí)病毒的天然構(gòu)象,具有較好的免疫原性。我們?cè)谠撗芯恐欣昧餍卸局甑闹饕Y(jié)構(gòu)蛋白基因,通過(guò)昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建和生產(chǎn)PEDV VLPs,并對(duì)其免疫原性進(jìn)行初步研究。我們選擇了PEDV流行毒株的纖突蛋白(Spike Protein,S)、膜蛋白(Membrane protein,M)和包膜蛋白(Envelop Protein,E)基因構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-2S、pFastBac-Dual-2M、pFastBac-Dual-2E,并進(jìn)一步拯救了重組桿狀病毒rpFastBac-Dual-2S、rpFastBac-Dual-2M、rp FastBac-Dual-2E,以共感染的方式感染Sf9細(xì)胞制備出PEDV VLPs。對(duì)制備的PEDV VLPs我們分別通過(guò)透射電鏡觀察、間接免疫熒光和Western Blotting方法對(duì)其外部形態(tài)和組成成分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,我們獲得了外部形態(tài)與原始病毒外部形態(tài)相似的PEDV VLPs;而且我們獲得的PEDV VLPs是由PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白S、M和E蛋白共同組裝形成。通過(guò)肌肉注射免疫小鼠,對(duì)PEDV VLPs的免疫原性進(jìn)行初步分析。檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)、ELISpot分析和胞內(nèi)因子染色分析結(jié)果表明,PEDV VLPs能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗PEDV中和抗體,與對(duì)照組相比,表現(xiàn)出極顯著的差異。說(shuō)明PEDV VLPs具有很好的免疫原性。而且在免疫PEDV VLPs的小鼠中,誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了較高水平的IFN-γ和IL-4;經(jīng)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞雙染色分析表明,CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均產(chǎn)生了較高水平的IFN-γ和IL-4;且與對(duì)照組相比,差異顯著。表明PEDV VLPs能夠誘導(dǎo)小鼠機(jī)體分別產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。因此,以PEDV VLPs為基礎(chǔ)開發(fā)PEDV疫苗具有潛在的發(fā)展空間。PEDV主要引起新生仔豬的胃腸道病變,所以我們考慮到免疫接種的疫苗應(yīng)以能夠誘導(dǎo)懷孕母豬的粘膜免疫為主,使新生仔豬能夠獲得足夠的粘膜免疫的抗體sIgA�；诖�,我們?cè)赑EDV VLPs的基礎(chǔ)上,又構(gòu)建了表達(dá)CTB融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pFastBac-Dual-2CTB,并進(jìn)一步拯救重組桿狀病毒rpFastBac-Dual-2CTB,使rpFastBac-Dual-2CTB與rpFastBac-Dual-2S、rpFastBac-Dual-2M、rp FastBac-Dual-2E共感染Sf9細(xì)胞,制備出嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs。對(duì)于制備的嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs,我們分別通過(guò)透射電鏡觀察、間接免疫熒光和Western Blotting方法對(duì)其外部形態(tài)和組成成分進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,我們獲得了外部形態(tài)與原始病毒相似的嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs。利用嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs口服免疫小鼠和豬,經(jīng)血清中和抗體檢測(cè)分析表明,在小鼠和豬的血清中均產(chǎn)生了較高水平的抗PEDV中和抗體;在小鼠的小腸液和豬的初乳中也分別檢測(cè)到了較高水平的sIgA抗體。證明嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫應(yīng)答,還能刺激機(jī)體產(chǎn)生局部的體液免疫應(yīng)答。經(jīng)ELISpot分析和細(xì)胞內(nèi)因子雙染色分析表明,嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs經(jīng)口服免疫均能刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的IFN-γ和IL-4。表明嵌合CTB的PEDV VLPs能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。綜上所述,我們以昆蟲-桿狀病毒為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的PEDV VLPs具有很好的免疫原性,表明以PEDV VLPs為基礎(chǔ),開發(fā)抗PEDV疫苗的研究有著廣闊的發(fā)展空間和發(fā)展?jié)摿�。在本試�?yàn)中,我們選擇了能夠刺激粘膜免疫的CTB作為粘膜免疫疫苗的分子佐劑,構(gòu)建嵌合CTB的嵌合型PEDV VLPs進(jìn)行口服免疫,取得了良好的免疫效果。本研究為抗PEDV粘膜免疫疫苗的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.651

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