本文關(guān)鍵詞：RBSDV與SRBSDV病毒質(zhì)蛋白P9-1結(jié)合單鏈RNA的結(jié)構(gòu)與生化特性研究　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked ddwarf virus,RBSDV)及南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black streaked dwarf virus SRBSDV)在分類上同屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus),兩種病毒的基因組均由10條dsRNA組成,基因組S9第一個(gè)開放閱讀框架編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白P9-1分子量大小均為40kDa,是病毒質(zhì)蛋白。病毒質(zhì)蛋白是組成病毒質(zhì)的最小組分,而病毒質(zhì)被認(rèn)為是病毒復(fù)制組裝的集中場所,包含病毒蛋白、病毒RNAs、外殼蛋白及不完整或完整的病毒顆粒。病毒質(zhì)蛋白的表達(dá)受到破壞或抑制將導(dǎo)致病毒質(zhì)無法形成,使病毒失去復(fù)制的場所,因此病毒質(zhì)蛋白是病毒進(jìn)行復(fù)制必需的蛋白,可以作為抗病研究的一個(gè)靶標(biāo)因子。病毒質(zhì)蛋白具有募集并結(jié)合基因組RNA復(fù)制產(chǎn)生dsRNA的特性,但是目前對這兩個(gè)病毒P9-1蛋白在病毒質(zhì)中的自身屬性及其生物學(xué)特性尚不清楚,我們通過體外的生化實(shí)驗(yàn)深入了解RBSDV P9-1及SRBSDV P9-1結(jié)合單鏈RNA的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性。1 RBSDV病毒質(zhì)蛋白P9-1結(jié)合單鏈RNA的結(jié)構(gòu)與生化特性研究我們通過鎳柱純化方式在體外大量表達(dá)純化RBSDV P9-1蛋白,用于蛋白結(jié)構(gòu)及其與單鏈RNA結(jié)合生化特性的分析。瓊脂糖膠凝膠阻滯及核酸競爭試驗(yàn)表明RBSDV P9-1優(yōu)先結(jié)合單鏈核酸,但不具有結(jié)合特異性;P9-1蛋白與單鏈RNA發(fā)生結(jié)合會形成許多大小不同的中間復(fù)合物;非變性不連續(xù)梯度PAGE電泳及分子篩層析表明,RBSDVP9-1能形成一系列從低位體到高位體的多聚體蛋白構(gòu)型,分別為二體、四體、八體等,其中二體是其主要多體狀態(tài);非變性不連續(xù)梯度PAGE電泳與凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析顯示RBSDV P9-1的八體結(jié)構(gòu)是結(jié)合單鏈RNA的主要形式,據(jù)此我們提出八體結(jié)合模型;在原有報(bào)道的RBSDV P9-1晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,對RBSDVP9-1 C端手臂序列缺失,發(fā)現(xiàn)突變體不再形成八體,而結(jié)合單鏈RNA的能力也受到影響;軟件預(yù)測表明RBSDV P9-1存在兩個(gè)結(jié)合RNA的結(jié)構(gòu)域:25-44位殘基與319-327位殘基;氨基酸替換分析2544位氨基酸殘基中帶正電荷氨基酸是結(jié)合RNA的重要位點(diǎn),并且影響蛋白八體結(jié)構(gòu)的形成,25-44位氨基酸殘基定位于八體晶體結(jié)構(gòu)的中心孔結(jié)構(gòu)。本研究為呼腸孤病毒屬家族中的其他病毒的病毒質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)與生化功能研究提供了嶄新的視角。2 SRBSDV病毒質(zhì)蛋白P9-1結(jié)合單鏈RNA的結(jié)構(gòu)與生化特性研究SRBSDVP9-1蛋白與RBSDVP9-1的同源性為77%,但是前人研究表明SRBSDV形成一種新型的病毒質(zhì),因此本研究對其進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)與生化特性的初探。我們在體外大量表達(dá)帶His標(biāo)簽的SRBSDV P9-1用于分析蛋白的生化特征分析。鎳柱純化回收的蛋白在4-16%非變性PAGE膠上形成一系列多聚體蛋白形態(tài),在自然狀態(tài)下,分別聚合形成二體、四體、六體、八體,但與RBSDVP9-1不同的是,SRBSDVP9-1蛋白以高聚體(如八體)為主要存在形式;凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析顯示,SRBSDV P9-1具有結(jié)合單鏈RNA的活性,且以八體結(jié)構(gòu)為主要結(jié)合形式;SRBSDV P9-1蛋白的C端對八體的形成也具有重要作用,C端23個(gè)氨基酸的缺失導(dǎo)致八體不再形成,并且其結(jié)合RNA的能力受到影響;丙氨酸替換試驗(yàn)表明SRBSDVP9-1氨基端R26、R39、K43、K44這四個(gè)帶正電的氨基酸是主要的RNA結(jié)合位點(diǎn),這四個(gè)位點(diǎn)突變后幾乎喪失結(jié)合單鏈RNA的能力,并且突變體只形成少量八體;氨基酸序列比對,SRBSDV P9-1與RBSDV P9-1差異存在于131-160位殘基序列,將SRBSDV P9-1的該段殘基置換到RBSDVP9-1相對應(yīng)的區(qū)域非但沒有增加八體,反而影響RBSDVP9-1八體結(jié)構(gòu)的形成,同時(shí)結(jié)合單鏈RNA的能力減弱,該結(jié)果表明僅有RNA結(jié)合位點(diǎn)但不具備八體構(gòu)象將不能有效結(jié)合單鏈RNA,因此蛋白構(gòu)象與結(jié)合位點(diǎn)共同決定蛋白結(jié)合RNA的能力,當(dāng)兩者完全匹配時(shí),蛋白結(jié)合RNA的活性將達(dá)到最大。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.11

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本文編號：1330370