本文關(guān)鍵詞：玉米胞質(zhì)類受體蛋白激酶基因ZmSTK2_USP的功能研究　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：花粉發(fā)育與花粉管伸長(zhǎng)是玉米有性生殖過(guò)程中的重要事件,直接影響到玉米產(chǎn)量的高低和質(zhì)量的好壞�；ǚ郯l(fā)育與花粉管伸長(zhǎng)過(guò)程的分子機(jī)制極其復(fù)雜,除包括一系列器官分化和一系列嚴(yán)格控制的細(xì)胞生理生化變化外,還涉及大批基因的表達(dá)與調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)一種新型的花粉發(fā)育相關(guān)胞質(zhì)類受體蛋白激酶基因ZmSTK2_USP,具有調(diào)控玉米花粉的發(fā)育和花粉管伸長(zhǎng)的生物學(xué)功能。研究取得的主要內(nèi)容如下:(1)生物信息學(xué)分析表明,玉米ZmSTK2_USP基因的編碼蛋白N-末端具有普通脅迫蛋白A(UspA)受體結(jié)構(gòu)域,C-末端具有絲氨酸/蘇氨酸激酶(STK)結(jié)構(gòu)域;屬于RLCK-IⅨb 亞家族。其啟動(dòng)子(proZmSTK2_USP)除含有 TATA-box、CAAT-box、G-box和GATA-box啟動(dòng)子典型元件外,還具有花粉特異性啟動(dòng)子元件GTGA和AGAAA。(2)花粉活力研究表明,突變體zmstk2_usp的花粉生活力下降43.30%,萌發(fā)率下降45.08%,以致單穗結(jié)實(shí)率下降約60.00%,且差異均達(dá)到極顯著水平。(3)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因,Northern blot檢測(cè)分析表明,ZmSTK2_USP基因僅在成熟的花粉中特異性表達(dá),且在其它組織(器官)中均未檢測(cè)到。熒光定量PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),ZmSTK2_USP基因在玉米花粉發(fā)育中期開(kāi)始表達(dá),且在成熟花粉中特異性表達(dá)。(4)本研究成功構(gòu)建2個(gè)表達(dá)載體ZmSTK2_USP-GUS和ZmSTK2_USP-GFP,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米萌動(dòng)胚轉(zhuǎn)化的方法獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果表明,玉米轉(zhuǎn)基因植株ZmSTK2_USP-GUS的幼小雄花、成熟雄花、成熟花藥以及花粉ESP時(shí)期均未檢測(cè)到GUS活性,但在花粉MSP時(shí)期、成熟期直至花粉管伸長(zhǎng)均檢測(cè)到GUS活性;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)洋蔥和煙草進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,觀察到ZmSTK2_USP-GFP融合蛋白在洋蔥表皮和煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)都被定位在細(xì)胞質(zhì)中,說(shuō)明ZmSTK2_USP基因編碼的蛋白屬于胞質(zhì)蛋白,這也為生物信息學(xué)分析中猜測(cè)ZmSTK2_USP屬于胞質(zhì)類受體蛋白激酶提供了依據(jù)。(5)本研究成功克隆到ZmSTK2_USP基因的啟動(dòng)子(proZmSTK2_USP),并成功構(gòu)建表達(dá)載體proZmSTK2_USP-GUS,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米萌動(dòng)胚轉(zhuǎn)化的方法獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株,GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn),proZmSTK2_USP在成熟花粉和花粉萌發(fā)過(guò)程中調(diào)控基因表達(dá),是一個(gè)花粉特異性啟動(dòng)子,這也驗(yàn)證了生物信息學(xué)分析的結(jié)果。(6)本研究還成功克隆到ZmSTK2__USP的激酶域(ZmSTK2__USP-KD),并構(gòu)建帶有His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET30a-His-ZmSTK2_USP-KD,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(E.coli)進(jìn)行體外原核表達(dá);目的融合蛋白為包涵體蛋白,最適誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.5mM、誘導(dǎo)溫度37℃和誘導(dǎo)時(shí)間5hr,沉淀菌體需8M尿素溶液溶解處理。采用32P放射性同位素成像法及其激酶通用抗體的檢測(cè),鑒定出ZmSTK2_USP的激酶域能夠發(fā)生自磷酸化,也可以催化組蛋白H1磷酸化,與此同時(shí)ZmSTK2_USP具有Ser/Thr蛋白激酶活性,不具有Tyr蛋白激酶活性,從而說(shuō)明ZmSTK2_USP是一種非雙底物特異性激酶。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S513

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本文編號(hào)：1320957