本文關鍵詞：Hsp90誘導表達對熱應激損傷雞心肌細胞的保護作用及其機理的研究　出處：《南京農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：長時間、高強度的應激刺激會對機體重要組織器官(特別是心臟)造成嚴重病理損害。眾多應激原可以影響畜禽生產和繁殖性能。熱應激可以導致雞生長速度降低、產蛋量下降,甚至導致雞的突然性死亡,而這種死亡與應激誘導的心臟疾病密切相關。生物有機體在遭受應激刺激時會激發(fā)自身一種適應性防御性應激反應。在此過程中,機體細胞會在多種熱休克因子(Heat shock factor, HSF)的調控下迅速合成一系列熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)而發(fā)揮保護作用。HSPs可以有效保護組織細胞免于各種應激性病理損傷和凋亡,其中,最為重要的熱休克蛋白家族之一便是HSP90家族。Hsp90有助于其客戶蛋白(Clientprotein)分子結構的成熟和穩(wěn)定性保持,而這些客戶蛋白多為細胞促生存/抗凋亡信號轉導通路的關鍵蛋白。阿司匹林(ASA)可以降低機體對溫度的敏感性閾值,從而更好地誘導機體發(fā)生應激保護性反應,如在熱應激過程中誘導Hsp70的高表達。本文在成功建立體內、外雞心肌細胞熱應激模型的基礎上動態(tài)研究了阿司匹林在熱應激過程中對雞心肌細胞Hsp90表達水平的影響及其抵抗細胞病理損傷/凋亡的作用,并從HSFs表達動力曲線和Hsp90相關信號轉導通路兩方面深入探討了阿司匹林在上述過程中的調控與保護機制;同時,本文利用ASA和格爾德霉素(GA)分別作為Hsp90的誘導劑和抑制劑,在雞原代心肌細胞水平上系統(tǒng)證明了 Hsp90誘導表達對于雞心肌細胞抵抗熱應激損傷/凋亡的作用及其機制。在建立雞心肌細胞的體內、體外熱應激模型基礎上,于試驗前2 h使用藥物ASA(劑量分別為1 mg/kg體重和1 mg/mL)對試驗雞或者離體培養(yǎng)的心肌細胞分別進行飼喂或處理,以觀察其對熱應激處理后體內、體外心肌細胞熱應激損傷的緩解作用。雞心肌細胞體內熱應激模型的建立選取飼養(yǎng)至21日齡的SPF雞,體外培養(yǎng)的熱應激雞心肌細胞模型則采用雞原代心肌細胞。試驗組包括熱應激組(HS),阿司匹林+熱應激組(ASA+HS)和阿司匹林組(ASA),其中HS組和ASA+HS組試驗雞/雞原代心肌細胞均于42℃條件下分別進行熱應激處理,并分別于熱應激處理至0h, lh, 2 h, 3 h,5 h, 7 h, 10 h, 15 h和24 h時隨機自各試驗組中選取10只雞或3個平皿的心肌細胞進行采樣,采集的活體受試雞的血清和培養(yǎng)皿中離體培養(yǎng)原代心肌細胞上清液直接送檢,分別檢測其中谷草轉氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。而采取的雞心肌組織和培養(yǎng)皿中的心肌細胞則分別用4%多聚甲醛固定。試驗結果顯示,熱應激開始后,HS組受試雞出現(xiàn)張口呼吸、呼吸頻率增加、飲水量劇增和攝食量顯著下降,受試雞體溫驟升至43℃。ASA+HS組受試雞也表現(xiàn)拍打翅膀,飲水量增加和呼吸頻率增加等癥狀;熱應激后HS組受試雞血清中AST、CK和LDH的活性水平顯著增加。而ASA+HS組和ASA組受試雞的相應酶則水平變化不大;組織病理學觀察結果顯示,熱應激導致HS組受試雞心肌細胞產生明顯的以急性變性如顆粒變性和水泡變性為特征的變化,甚至出現(xiàn)心肌細胞核固縮、核碎裂,而ASA+HS組受試雞心肌細胞則沒有出現(xiàn)明顯的核固縮、核碎裂等病理變化;體外培養(yǎng)的心肌細胞則顯示,HS組心肌細胞培養(yǎng)上清中AST、CK和LDH水平顯著升高,心肌細胞發(fā)生明顯的顆粒變性和水泡變性,甚至出現(xiàn)核固縮、核碎裂等明顯病理變化。而經過ASA處理的心肌細胞熱應激損傷明顯減輕,主要表現(xiàn)為細胞培養(yǎng)上清液中損傷相關酶的活性很多恢復至正常水平,心肌細胞也沒有出現(xiàn)明顯的細胞壞死特征。上述研究表明,ASA可以在體內、體外水平上顯著減輕熱應激對雞心肌細胞的損傷及其程度。通過給試驗雞提前2 h飼喂ASA (1 mg/kg . bw),然后將受試雞暴露于42℃環(huán)境下分別進行0,1, 2, 3,5,7, 10,15和24 h的熱應激處理,利用免疫組織化學和分子生物學檢測方法,觀察hsp90 mRNA,Hsp90和HSF在熱應激過程中的變化規(guī)律,以探討ASA是否通過Hsp90表達量的改變參與心肌細胞抗應激性病理損傷及其機理。試驗結果顯示,熱應激過程中,雞心肌細胞內HSF-1的誘導與消耗、HSF-2和HSF-3的下調導致了hsp90 mRNA轉錄啟動的推遲。而ASA的飼喂不同程度地改變了HSF-1, 2, 3的表達水平,從而使雞心肌細胞hsp90 mRNA在整個熱應激過程中處于高表達狀態(tài),進而誘導了雞心肌細胞Hsp90蛋白的提前高表達。同時,免疫組織化學檢測結果顯示,飼喂ASA可明顯提高熱應激過程中Hsp90在雞心肌細胞核中以及心肌組織動脈、毛細血管內皮細胞中的滯留時間。說明ASA在機體內可通過調節(jié)雞心肌細胞中HSFs的表達,進而誘導Hsp90的顯著高表達及其在細胞核中的滯留,這與ASA有效提高雞心肌細胞抗熱應激損傷能力有顯著關聯(lián)。利用RT-PCR,western blot, ELISA和TUNEL原位雜交技術等,分別對飼喂AS A后不同時間熱應激處理的受試雞的心臟組織中hsp90mRNA轉錄水平、Hsp90蛋白表達、抗凋亡關鍵蛋白Akt表達與激活水平,以及心肌細胞凋亡率等方面進行動態(tài)觀察。試驗結果顯示,暴露于熱應激環(huán)境后,雞心肌細胞中hsp90 mRNA轉錄和Hsp90蛋白表達均出現(xiàn)明顯延遲,抑制了 Akt的表達與激活,進而導致雞心肌細胞內caspase-3與caspase-9活性和心肌細胞熱應激凋亡率的顯著升高。提前進行ASA飼喂處理后則可提前顯著上調hsp90mRNA的基因轉錄(P0.01)與其相應蛋白Hsp90的表達(2.3-4.1倍)。由此Akt的表達與激活水平也被相應提高,這有效抑制了心肌細胞內caspase-3與caspase-9的活性和心肌細胞的熱應激凋亡率(降低2.14 - 2.56倍)。試驗結果證實,提前進行ASA飼喂可以通過顯著提前/提高雞心肌細胞中Hsp90表達,誘導并激活抗凋亡信號通路關鍵蛋白Akt,進而有效抑制其熱應激凋亡。利用PCR,western blot,免疫細胞化學和細胞學檢測技術,檢測經ASA處理后體外培養(yǎng)雞原代心肌細胞在熱應激過程中應激性病理損傷、ASA處理對雞原代心肌細胞hsp90 mRNA轉錄和Hsp90表達的誘導作用,探討ASA誘導Hsp90表達、緩解雞原代心肌細胞熱應激損傷的保護作用及其機理。結果發(fā)現(xiàn),用ASA (1 mg/mL)提前2 h處理離體培養(yǎng)的心肌細胞,然后對體外培養(yǎng)心肌細胞進行熱應激處理后,ASA在不影響雞原代心肌細胞活性的條件下可顯著誘導其Hsp90的高表達。而在42℃熱應激處理過程中,ASA處理的雞心肌細胞在熱應激過程中出現(xiàn)了更強的Hsp90細胞質陽性信號,且Hsp90在細胞核內的滯留時間更為持久。相對于熱應激組心肌細胞Hsp90在熱應激過程中的4.1倍升高且快速下調,ASA處理的雞心肌細胞Hsp90表達則是在高熱應激前即出現(xiàn)顯著升高(約11.1倍),并在熱應激前期一直保持較高水平。同時,在整個試驗過程中ASA處理的心肌細胞內hsp90 mRNA轉錄保持高表達,而熱應激組心肌細胞內的hsp90mRNA轉錄則一直低于應激前水平。結果表明,ASA處理可以顯著誘導心肌細胞Hsp90的高表達,而且在熱應激前用ASA誘導Hsp90提前高表達可使雞原代心肌細胞在熱應激過程中維持更高水平的Hsp90,特別是在細胞核中。在系統(tǒng)評價ASA對雞原代心肌細胞Hsp90的誘導表達和GA對其Hsp90的抑制表達基礎上,分別用ASA和GA預處理雞原代心肌細胞,然后進行熱應激處理。結果發(fā)現(xiàn),雞原代心肌細胞的細胞活性、凋亡率和氧化應激水平在熱應激初期即受到顯著影響,且隨著應激時間的延長,這種損傷程度越大;0.1 μM及以上濃度的GA處理雞原代心肌細胞可以有效抑制其Hsp90的表達水平。而ASA則可以顯著(P0.05)提高心肌細胞熱應激后的Hsp90表達,同時心肌細胞的活性更高、凋亡率和氧化應激水平更低;GA可以下調細胞熱應激后的Hsp90表達(P0.05),此時心肌細胞的活性更低、凋亡率和氧化應激水平更高;對于GA預處理的心肌細胞,與單獨用GA處理的熱應激心肌細胞相比,ASA處理則只能有限地提高熱應激后心肌細胞Hsp90表達,這時心肌細胞的活性改善不明顯、凋亡率和氧化應激水平均有一定程度的降低。研究結果說明,熱應激過程中雞原代心肌細胞活性、凋亡率和氧化應激水平均(即抗熱應激損傷能力)與其Hsp90表達水平密切相關。采用Hsp90誘導劑ASA和抑制劑GA預處理體外培養(yǎng)的雞原代心肌細胞,然后進行5 h的熱應激處理后發(fā)現(xiàn),與熱應激組心肌細胞相比,ASA處理可有效上調熱應激心肌細胞中Akt, STAT-3和p-IKKα/β的表達,Akt、STAT-3與Hsp90的共定位也相應提高,此時caspases酶的活性也相對較低;GA處理可顯著抑制Akt表達和p-IKKα/β水平,但可誘導STAT-3的高表達,同時Akt、STAT-3與Hsp90的共定位也明顯降低,伴隨著相對較高的caspases酶活性;GA預處理后,再用ASA處理雞原代心肌細胞后,熱應激處理心肌細胞內caspases酶活性被部分抑制,Akt表達水平及其與Hsp90的共定位一定程度上得到恢復,STAT-3與p-IKKα/β的表達被進一步下調,其與Hsp90的共定位也沒有明顯恢復。試驗結果表明,不同Hsp90表達水平通過其對重要靶蛋白的調節(jié),對雞原代心肌細胞的抗應激性損傷和細胞凋亡具有關鍵的調控作用,而當Hsp90表達首先被抑制時,后續(xù)的Hsp90誘導劑處理則只能有限地提升心肌細胞的抗熱應激能力。
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
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本文編號：1318469