本文關(guān)鍵詞：Hsp90誘導(dǎo)表達(dá)對熱應(yīng)激損傷雞心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)理的研究　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：長時(shí)間、高強(qiáng)度的應(yīng)激刺激會對機(jī)體重要組織器官(特別是心臟)造成嚴(yán)重病理損害。眾多應(yīng)激原可以影響畜禽生產(chǎn)和繁殖性能。熱應(yīng)激可以導(dǎo)致雞生長速度降低、產(chǎn)蛋量下降,甚至導(dǎo)致雞的突然性死亡,而這種死亡與應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟疾病密切相關(guān)。生物有機(jī)體在遭受應(yīng)激刺激時(shí)會激發(fā)自身一種適應(yīng)性防御性應(yīng)激反應(yīng)。在此過程中,機(jī)體細(xì)胞會在多種熱休克因子(Heat shock factor, HSF)的調(diào)控下迅速合成一系列熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)而發(fā)揮保護(hù)作用。HSPs可以有效保護(hù)組織細(xì)胞免于各種應(yīng)激性病理損傷和凋亡,其中,最為重要的熱休克蛋白家族之一便是HSP90家族。Hsp90有助于其客戶蛋白(Clientprotein)分子結(jié)構(gòu)的成熟和穩(wěn)定性保持,而這些客戶蛋白多為細(xì)胞促生存/抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白。阿司匹林(ASA)可以降低機(jī)體對溫度的敏感性閾值,從而更好地誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激保護(hù)性反應(yīng),如在熱應(yīng)激過程中誘導(dǎo)Hsp70的高表達(dá)。本文在成功建立體內(nèi)、外雞心肌細(xì)胞熱應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上動態(tài)研究了阿司匹林在熱應(yīng)激過程中對雞心肌細(xì)胞Hsp90表達(dá)水平的影響及其抵抗細(xì)胞病理損傷/凋亡的作用,并從HSFs表達(dá)動力曲線和Hsp90相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路兩方面深入探討了阿司匹林在上述過程中的調(diào)控與保護(hù)機(jī)制;同時(shí),本文利用ASA和格爾德霉素(GA)分別作為Hsp90的誘導(dǎo)劑和抑制劑,在雞原代心肌細(xì)胞水平上系統(tǒng)證明了 Hsp90誘導(dǎo)表達(dá)對于雞心肌細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激損傷/凋亡的作用及其機(jī)制。在建立雞心肌細(xì)胞的體內(nèi)、體外熱應(yīng)激模型基礎(chǔ)上,于試驗(yàn)前2 h使用藥物ASA(劑量分別為1 mg/kg體重和1 mg/mL)對試驗(yàn)雞或者離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分別進(jìn)行飼喂或處理,以觀察其對熱應(yīng)激處理后體內(nèi)、體外心肌細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的緩解作用。雞心肌細(xì)胞體內(nèi)熱應(yīng)激模型的建立選取飼養(yǎng)至21日齡的SPF雞,體外培養(yǎng)的熱應(yīng)激雞心肌細(xì)胞模型則采用雞原代心肌細(xì)胞。試驗(yàn)組包括熱應(yīng)激組(HS),阿司匹林+熱應(yīng)激組(ASA+HS)和阿司匹林組(ASA),其中HS組和ASA+HS組試驗(yàn)雞/雞原代心肌細(xì)胞均于42℃條件下分別進(jìn)行熱應(yīng)激處理,并分別于熱應(yīng)激處理至0h, lh, 2 h, 3 h,5 h, 7 h, 10 h, 15 h和24 h時(shí)隨機(jī)自各試驗(yàn)組中選取10只雞或3個(gè)平皿的心肌細(xì)胞進(jìn)行采樣,采集的活體受試雞的血清和培養(yǎng)皿中離體培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞上清液直接送檢,分別檢測其中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性。而采取的雞心肌組織和培養(yǎng)皿中的心肌細(xì)胞則分別用4%多聚甲醛固定。試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激開始后,HS組受試雞出現(xiàn)張口呼吸、呼吸頻率增加、飲水量劇增和攝食量顯著下降,受試雞體溫驟升至43℃。ASA+HS組受試雞也表現(xiàn)拍打翅膀,飲水量增加和呼吸頻率增加等癥狀;熱應(yīng)激后HS組受試雞血清中AST、CK和LDH的活性水平顯著增加。而ASA+HS組和ASA組受試雞的相應(yīng)酶則水平變化不大;組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,熱應(yīng)激導(dǎo)致HS組受試雞心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的以急性變性如顆粒變性和水泡變性為特征的變化,甚至出現(xiàn)心肌細(xì)胞核固縮、核碎裂,而ASA+HS組受試雞心肌細(xì)胞則沒有出現(xiàn)明顯的核固縮、核碎裂等病理變化;體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞則顯示,HS組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST、CK和LDH水平顯著升高,心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的顆粒變性和水泡變性,甚至出現(xiàn)核固縮、核碎裂等明顯病理變化。而經(jīng)過ASA處理的心肌細(xì)胞熱應(yīng)激損傷明顯減輕,主要表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)上清液中損傷相關(guān)酶的活性很多恢復(fù)至正常水平,心肌細(xì)胞也沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死特征。上述研究表明,ASA可以在體內(nèi)、體外水平上顯著減輕熱應(yīng)激對雞心肌細(xì)胞的損傷及其程度。通過給試驗(yàn)雞提前2 h飼喂ASA (1 mg/kg . bw),然后將受試雞暴露于42℃環(huán)境下分別進(jìn)行0,1, 2, 3,5,7, 10,15和24 h的熱應(yīng)激處理,利用免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)檢測方法,觀察hsp90 mRNA,Hsp90和HSF在熱應(yīng)激過程中的變化規(guī)律,以探討ASA是否通過Hsp90表達(dá)量的改變參與心肌細(xì)胞抗應(yīng)激性病理損傷及其機(jī)理。試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激過程中,雞心肌細(xì)胞內(nèi)HSF-1的誘導(dǎo)與消耗、HSF-2和HSF-3的下調(diào)導(dǎo)致了hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄啟動的推遲。而ASA的飼喂不同程度地改變了HSF-1, 2, 3的表達(dá)水平,從而使雞心肌細(xì)胞hsp90 mRNA在整個(gè)熱應(yīng)激過程中處于高表達(dá)狀態(tài),進(jìn)而誘導(dǎo)了雞心肌細(xì)胞Hsp90蛋白的提前高表達(dá)。同時(shí),免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,飼喂ASA可明顯提高熱應(yīng)激過程中Hsp90在雞心肌細(xì)胞核中以及心肌組織動脈、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的滯留時(shí)間。說明ASA在機(jī)體內(nèi)可通過調(diào)節(jié)雞心肌細(xì)胞中HSFs的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)Hsp90的顯著高表達(dá)及其在細(xì)胞核中的滯留,這與ASA有效提高雞心肌細(xì)胞抗熱應(yīng)激損傷能力有顯著關(guān)聯(lián)。利用RT-PCR,western blot, ELISA和TUNEL原位雜交技術(shù)等,分別對飼喂AS A后不同時(shí)間熱應(yīng)激處理的受試雞的心臟組織中hsp90mRNA轉(zhuǎn)錄水平、Hsp90蛋白表達(dá)、抗凋亡關(guān)鍵蛋白Akt表達(dá)與激活水平,以及心肌細(xì)胞凋亡率等方面進(jìn)行動態(tài)觀察。試驗(yàn)結(jié)果顯示,暴露于熱應(yīng)激環(huán)境后,雞心肌細(xì)胞中hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄和Hsp90蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯延遲,抑制了 Akt的表達(dá)與激活,進(jìn)而導(dǎo)致雞心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3與caspase-9活性和心肌細(xì)胞熱應(yīng)激凋亡率的顯著升高。提前進(jìn)行ASA飼喂處理后則可提前顯著上調(diào)hsp90mRNA的基因轉(zhuǎn)錄(P0.01)與其相應(yīng)蛋白Hsp90的表達(dá)(2.3-4.1倍)。由此Akt的表達(dá)與激活水平也被相應(yīng)提高,這有效抑制了心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3與caspase-9的活性和心肌細(xì)胞的熱應(yīng)激凋亡率(降低2.14 - 2.56倍)。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),提前進(jìn)行ASA飼喂可以通過顯著提前/提高雞心肌細(xì)胞中Hsp90表達(dá),誘導(dǎo)并激活抗凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白Akt,進(jìn)而有效抑制其熱應(yīng)激凋亡。利用PCR,western blot,免疫細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù),檢測經(jīng)ASA處理后體外培養(yǎng)雞原代心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激過程中應(yīng)激性病理損傷、ASA處理對雞原代心肌細(xì)胞hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄和Hsp90表達(dá)的誘導(dǎo)作用,探討ASA誘導(dǎo)Hsp90表達(dá)、緩解雞原代心肌細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用ASA (1 mg/mL)提前2 h處理離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,然后對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,ASA在不影響雞原代心肌細(xì)胞活性的條件下可顯著誘導(dǎo)其Hsp90的高表達(dá)。而在42℃熱應(yīng)激處理過程中,ASA處理的雞心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激過程中出現(xiàn)了更強(qiáng)的Hsp90細(xì)胞質(zhì)陽性信號,且Hsp90在細(xì)胞核內(nèi)的滯留時(shí)間更為持久。相對于熱應(yīng)激組心肌細(xì)胞Hsp90在熱應(yīng)激過程中的4.1倍升高且快速下調(diào),ASA處理的雞心肌細(xì)胞Hsp90表達(dá)則是在高熱應(yīng)激前即出現(xiàn)顯著升高(約11.1倍),并在熱應(yīng)激前期一直保持較高水平。同時(shí),在整個(gè)試驗(yàn)過程中ASA處理的心肌細(xì)胞內(nèi)hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄保持高表達(dá),而熱應(yīng)激組心肌細(xì)胞內(nèi)的hsp90mRNA轉(zhuǎn)錄則一直低于應(yīng)激前水平。結(jié)果表明,ASA處理可以顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Hsp90的高表達(dá),而且在熱應(yīng)激前用ASA誘導(dǎo)Hsp90提前高表達(dá)可使雞原代心肌細(xì)胞在熱應(yīng)激過程中維持更高水平的Hsp90,特別是在細(xì)胞核中。在系統(tǒng)評價(jià)ASA對雞原代心肌細(xì)胞Hsp90的誘導(dǎo)表達(dá)和GA對其Hsp90的抑制表達(dá)基礎(chǔ)上,分別用ASA和GA預(yù)處理雞原代心肌細(xì)胞,然后進(jìn)行熱應(yīng)激處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雞原代心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡率和氧化應(yīng)激水平在熱應(yīng)激初期即受到顯著影響,且隨著應(yīng)激時(shí)間的延長,這種損傷程度越大;0.1 μM及以上濃度的GA處理雞原代心肌細(xì)胞可以有效抑制其Hsp90的表達(dá)水平。而ASA則可以顯著(P0.05)提高心肌細(xì)胞熱應(yīng)激后的Hsp90表達(dá),同時(shí)心肌細(xì)胞的活性更高、凋亡率和氧化應(yīng)激水平更低;GA可以下調(diào)細(xì)胞熱應(yīng)激后的Hsp90表達(dá)(P0.05),此時(shí)心肌細(xì)胞的活性更低、凋亡率和氧化應(yīng)激水平更高;對于GA預(yù)處理的心肌細(xì)胞,與單獨(dú)用GA處理的熱應(yīng)激心肌細(xì)胞相比,ASA處理則只能有限地提高熱應(yīng)激后心肌細(xì)胞Hsp90表達(dá),這時(shí)心肌細(xì)胞的活性改善不明顯、凋亡率和氧化應(yīng)激水平均有一定程度的降低。研究結(jié)果說明,熱應(yīng)激過程中雞原代心肌細(xì)胞活性、凋亡率和氧化應(yīng)激水平均(即抗熱應(yīng)激損傷能力)與其Hsp90表達(dá)水平密切相關(guān)。采用Hsp90誘導(dǎo)劑ASA和抑制劑GA預(yù)處理體外培養(yǎng)的雞原代心肌細(xì)胞,然后進(jìn)行5 h的熱應(yīng)激處理后發(fā)現(xiàn),與熱應(yīng)激組心肌細(xì)胞相比,ASA處理可有效上調(diào)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞中Akt, STAT-3和p-IKKα/β的表達(dá),Akt、STAT-3與Hsp90的共定位也相應(yīng)提高,此時(shí)caspases酶的活性也相對較低;GA處理可顯著抑制Akt表達(dá)和p-IKKα/β水平,但可誘導(dǎo)STAT-3的高表達(dá),同時(shí)Akt、STAT-3與Hsp90的共定位也明顯降低,伴隨著相對較高的caspases酶活性;GA預(yù)處理后,再用ASA處理雞原代心肌細(xì)胞后,熱應(yīng)激處理心肌細(xì)胞內(nèi)caspases酶活性被部分抑制,Akt表達(dá)水平及其與Hsp90的共定位一定程度上得到恢復(fù),STAT-3與p-IKKα/β的表達(dá)被進(jìn)一步下調(diào),其與Hsp90的共定位也沒有明顯恢復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果表明,不同Hsp90表達(dá)水平通過其對重要靶蛋白的調(diào)節(jié),對雞原代心肌細(xì)胞的抗應(yīng)激性損傷和細(xì)胞凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用,而當(dāng)Hsp90表達(dá)首先被抑制時(shí),后續(xù)的Hsp90誘導(dǎo)劑處理則只能有限地提升心肌細(xì)胞的抗熱應(yīng)激能力。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
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本文編號：1318469