本文關(guān)鍵詞：抗RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻田間生物學(xué)調(diào)查及分子特征分析　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)是一種以灰飛虱為主要傳播介體,在我國主要水稻種植區(qū)廣泛流行的水稻病毒病。該病害常規(guī)方法難以有效防治,危害程度逐年加重,造成水稻的減產(chǎn)甚至絕產(chǎn),給我國水稻生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。RNA介導(dǎo)病毒抗性是目前培育抗病毒轉(zhuǎn)基因作物最有效、快捷的方法,轉(zhuǎn)基因植株具有抗性強(qiáng)、抗病持久性強(qiáng)、生物安全性高等特點(diǎn),具有重大應(yīng)用價(jià)值。本研究以實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)育獲得的抗水稻黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因水稻KRBSDV為實(shí)驗(yàn)材料,以受體鎮(zhèn)稻88為對照,對水稻的農(nóng)藝性狀、除草劑抗性、病毒抗性、種子營養(yǎng)成分等生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測;進(jìn)而對外源基因的整合、轉(zhuǎn)基因水稻與野生型之間在RNA和蛋白水平表達(dá)差異等分子生物學(xué)特性進(jìn)行了分析;同時(shí),從食品安全角度對轉(zhuǎn)基因水稻安全性進(jìn)行了評估。主要的研究結(jié)果和結(jié)論如下:(1)轉(zhuǎn)基因水稻的農(nóng)藝性狀、抗性及種營養(yǎng)成分分析農(nóng)藝性狀調(diào)查及抗性鑒定的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因水稻KRBSDV在生長各個(gè)時(shí)期,植株表型與鎮(zhèn)稻88在形態(tài)上無明顯差異,轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出良好的對PPT和RBSDV的抗性;種子營養(yǎng)成分析顯示,轉(zhuǎn)基因水稻種子中的水分、灰分、維生素含量、礦物質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量、植酸含量及胰蛋白酶抑制劑含量等與野生型水稻差異不顯著。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)入的發(fā)夾RNA(hpRNA)結(jié)構(gòu)的RBSDV-CPM基因能夠有效地干擾RBSDV的侵染,同時(shí)轉(zhuǎn)基因水稻的表型性狀并未受到插入基因的明顯影響。(2)Southern雜交表明,轉(zhuǎn)基因植株中外源基因?yàn)閱慰截?且只有一個(gè)插入位點(diǎn)。利用hiTAIL-PCR技術(shù)測定了轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)兩側(cè)序列,最終確認(rèn)插入位點(diǎn)為水稻二號(hào)染色體93244至94002bp區(qū)間,并伴隨著24個(gè)核苷酸缺失的現(xiàn)象。該插入位點(diǎn)位于兩個(gè)基因之間,這兩個(gè)基因均為編碼假定蛋白的基因。(3)提取分蘗期水稻葉片mRNA,利用RNA-seq進(jìn)行測序分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,KRBSDV與鎮(zhèn)稻88葉片mRNA表達(dá)共有6869條具有顯著差異(P0.05);兩者間表達(dá)顯著差異mRNA表達(dá)分布在全部12對染色體上,插入位點(diǎn)附近及水稻二號(hào)染色體上的差異表達(dá)顯著的m RNA數(shù)量,相對其他染色體并無明顯增多。轉(zhuǎn)基因水稻中,選擇標(biāo)記基因bar基因的相對表達(dá)量為10215,目的基因RBSDV-CPM基因的相對表達(dá)量為6531,在野生型水稻中未檢測到bar基因和RBSDV-CPM基因的表達(dá)。分析表達(dá)差異顯著的mRNA,發(fā)現(xiàn)其主要涉及轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄、結(jié)合蛋白、結(jié)構(gòu)分子活性等多種不同種類的蛋白,如核糖體、ATP轉(zhuǎn)運(yùn)合成相關(guān)蛋白、伴侶蛋白、熱敏蛋白、組蛋白等。(4)對KRBSDV轉(zhuǎn)基因水稻和鎮(zhèn)稻88種子蛋白質(zhì)進(jìn)行SWATH分析,共標(biāo)記蛋白1887種,其中346個(gè)蛋白表現(xiàn)出顯著差異,其中20s、40s、60s核糖體蛋白、ATP轉(zhuǎn)運(yùn)合成相關(guān)蛋白、幾種伴侶蛋白、谷蛋白、組蛋白和幾種病原菌誘導(dǎo)防御反應(yīng)蛋白以及熱敏蛋白含量與野生型間差異尤為顯著。選擇標(biāo)記基因bar基因表達(dá)的PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphinothricin N-acetyltransferase,PAT)在種子中能夠檢測出,但相對表達(dá)量不高;未檢測到目的基因片段RBSDV-CPM的表達(dá)。對表達(dá)差異顯著的蛋白進(jìn)行整體分析,發(fā)現(xiàn)根據(jù)功能劃分蛋白比例與測定到的整體功能蛋白比例接近。在NCBI檢索顯著差異蛋白序列,利用過敏原篩查數(shù)據(jù)庫The allergen Online Database對序列進(jìn)行篩查,未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻中產(chǎn)生新的致敏性蛋白和毒性蛋白。綜合以上結(jié)果,轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因的表達(dá)賦予水稻對除草劑PPT抗性,顯著地提高了水稻對RBSDV的抗性,但轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀及種子的營養(yǎng)成分與野生型水稻無顯著差異;外源基因的插入雖引起部分水稻基因在RNA水平和蛋白水平的差異表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)毒性蛋白和新的過敏原蛋白的產(chǎn)生,表明轉(zhuǎn)基因水稻具有良好的食品安全性。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511

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