本文關(guān)鍵詞：犬心絲蟲MTFP抗原定位及Dot-ELISA和膠體金試紙條檢測方法的建立　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：犬惡絲蟲病(Heartworm disease)又名犬心絲蟲病,是由犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)簡稱犬心絲蟲寄生于犬右心室及肺動脈而引起的疾病,偶爾也寄生于腹腔、眼前庭、皮下等部位,其傳播媒介為吸血昆蟲,呈世界性分布,對犬、貓和野生動物危害嚴(yán)重。感染犬惡絲蟲的動物血液內(nèi)含有犬心絲蟲的幼蟲-微絲蚴,微絲蚴經(jīng)蚊類傳播,甚至可感染人,導(dǎo)致肺部結(jié)節(jié)。犬心絲蟲病在我國分布較為廣泛,一些地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,該病的感染率可達(dá)40%以上。但是目前缺乏快速、便捷適用于臨床現(xiàn)場的檢測方法。因此建立一種特異、敏感、快速的免疫學(xué)診斷方法對該病的診斷及預(yù)防具有十分重要的意義。本研究利用本實驗室從犬心絲蟲c DNA文庫篩選獲得的犬心絲蟲特異的MTFP基因重組蛋白作為免疫抗原,制備單克隆抗體,之后對MTFP基因蛋白抗原進(jìn)行定位。利用純化的犬心絲蟲MTFP重組蛋白作為包被抗原建立Dot-ELISA檢測方法,并作為T線劃線抗原建立膠體金試紙條檢測方法,以期為犬心絲蟲病診斷提供快速簡便的方法。1、抗犬心絲蟲MTFP蛋白單克隆抗體的制備:本研究以犬心絲蟲MTFP重組蛋白為免疫抗原對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫,取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)篩選得到5株陽性雜交瘤細(xì)胞株(編號分別為7號、8號、11號、16號和20號)。對其進(jìn)行亞類鑒定,其中1株(11號)為Ig G1亞型、2株(8號和16號)為Ig G2a亞型、2株(7號和20號)為Ig M亞型。利用親和層析法對16號株進(jìn)行純化,單克隆抗體輕鏈、重鏈清晰可見,純化效果良好,經(jīng)間接ELISA檢測,其腹水抗體效價為2×105。2、MTFP基因蛋白在犬心絲蟲的定位:利用抗犬心絲蟲MTFP蛋白16號株單克隆抗體,通過激光掃描共聚焦顯微鏡對心絲蟲MTFP蛋白抗原進(jìn)行蟲體定位,發(fā)現(xiàn)MTFP基因蛋白表達(dá)于成蟲蟲體的肌層。3、犬心絲蟲Dot-ELISA檢測方法的建立:以犬心絲蟲MTFP重組蛋白為抗原建立犬心絲蟲Dot-ELISA檢測方法。通過優(yōu)化反應(yīng)條件,確定了最佳抗原包被量為0.5μg/片、最佳待檢血清稀釋度為1:50、最佳酶標(biāo)抗體稀釋度為1:4000。所建立的Dot-ELISA方法敏感性為1:200,且與犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清沒有交叉反應(yīng)。應(yīng)用所建立的Dot-ELISA方法檢測吉林省白城市62份犬血清,結(jié)果檢出3份陽性樣本,陽性率為4.8%。4、犬心絲蟲膠體金檢測試紙條的研制:利用犬心絲蟲MTFP重組蛋白建立了犬心絲蟲膠體金試紙條檢測方法。經(jīng)過一系列試驗確定了硝酸纖維素膜為Millipore 135s、金標(biāo)墊為玻璃纖維RB45、樣品墊為玻璃纖維SB08、T線蛋白最佳包被濃度為1mg/m L、C線抗體最佳包被濃度為0.5mg/m L。所制備的膠體金試紙條最低檢出限為1:8,穩(wěn)定性試驗表明試紙條至少可室溫存放2個月,重復(fù)性良好,且與犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清沒有交叉反應(yīng)。應(yīng)用所制備的膠體金試紙條檢測吉林省白城市62份犬血清,結(jié)果檢出4份陽性樣本,陽性率為6.4%。從而為犬心絲蟲感染的檢測提供了新的方法。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：1311009