本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用生物組學(xué)分析鑒定蘿卜鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)基因與miRNA　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：鹽脅迫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要的環(huán)境脅迫之一,嚴(yán)重地影響了蔬菜作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。蘿卜(Raphanus sativus L.)是原產(chǎn)于我國的一種重要根菜類作物,以膨大的肉質(zhì)直根為主要食用器官。蘿卜是一種中等鹽敏感型的作物。前人對(duì)蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的研究主要集中在結(jié)構(gòu)形態(tài)和生理生化方面,然而關(guān)于蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因和miRNA的分離鑒定研究尚未開展,導(dǎo)致蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制仍未完全闡明。因此,研究蘿卜鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制和遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已成為當(dāng)前蘿卜生產(chǎn)面臨的重要課題。鑒于此,本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-YH’為實(shí)驗(yàn)材料,從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白水平系統(tǒng)研究蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.為系統(tǒng)分離鑒定蘿卜鹽脅迫響應(yīng)過程中的miRNA及其靶基因,本研究構(gòu)建了對(duì)照組(CK)和鹽處理組(Na200)蘿卜肉質(zhì)根sRNA文庫,利用高通量測(cè)序技術(shù)從這兩個(gè)文庫中鑒定到136個(gè)已知miRNAs (屬于43個(gè)miRNA家族)和68個(gè)潛在的新型miRNAs (屬于51個(gè)miRNA家族)。其中,49個(gè)已知和22個(gè)新型miRNAs在鹽脅迫下是差異表達(dá)的。miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和注釋分析表明,這些鹽脅迫響應(yīng)的miRNAs主要通過調(diào)節(jié)特定的脅迫響應(yīng)基因(如SPLs、ARFs、NF-Y和CSD1等)的表達(dá)在蘿卜鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的功能分析表明,這些靶基因主要參與了信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子平衡調(diào)節(jié)、基本代謝過程、次級(jí)脅迫響應(yīng)和植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)等一系列生理生化過程。此外,通過RT-qPCR進(jìn)一步對(duì)10個(gè)鹽脅迫響應(yīng)miRNA和5個(gè)對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)所有被驗(yàn)證的miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致,且被驗(yàn)證的靶基因與其相應(yīng)miRNA之間在表達(dá)趨勢(shì)上存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果將對(duì)miRNA介導(dǎo)的蘿卜鹽脅迫響應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的認(rèn)識(shí),并有助于進(jìn)一步解析根菜類作物耐鹽性分子機(jī)制。2.為了在mRNA水平上分離鑒定蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的差異表達(dá)基因(DEGs),本研究通過構(gòu)建對(duì)照組(CK)和鹽處理組(Na200)蘿卜肉質(zhì)根cDNA文庫,利用基于高通量測(cè)序的RNA-Seq技術(shù)進(jìn)行蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的差異基因表達(dá)譜分析。共獲得8709個(gè)差異表達(dá)基因,包括3931個(gè)上調(diào)表達(dá)和4778個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。功能注釋分析表明,許多差異表達(dá)基因可能參與了蘿卜鹽脅迫響應(yīng)過程的幾個(gè)重要方面,包括脅迫信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)、離子平衡和活性氧清除等。鹽脅迫響應(yīng)基因和miRNA的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,36對(duì)miRNA與其對(duì)應(yīng)的靶基因(miRNA-mRNA)在表達(dá)趨勢(shì)上呈現(xiàn)出負(fù)調(diào)控關(guān)系。利用RT-qPCR對(duì)12個(gè)重要的鹽脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)與RNA-Seq分析結(jié)果高度一致。另外,基于轉(zhuǎn)錄組序列與同源克隆技術(shù),克隆得到了蘿卜RsAPX1和RsSOS2基因cDNA序列。其中,RsAPX1開放閱讀框(ORF)為753 bp,推導(dǎo)編碼250個(gè)氨基酸;RsSOS2開放閱讀框(ORF)長1329 bp,推導(dǎo)編碼442個(gè)氨基酸。利用RT-qPCR進(jìn)行了蘿卜鹽脅迫響應(yīng)過程中RsAPX1和RsSOS2基因的表達(dá)特征分析。結(jié)果表明,RsAPX1在鹽處理的中期階段(12 h和24 h)和低濃度的鹽處理下(50mM)的表達(dá)量顯著提高,然而隨著鹽處理時(shí)間和濃度的進(jìn)一步增加其表達(dá)受到明顯抑制;RsSOS2在不同鹽處理時(shí)間和不同濃度鹽處理下的表達(dá)均受到一定程度的誘導(dǎo)。研究成果將有助于進(jìn)一步解析鹽脅迫響應(yīng)分子機(jī)制,并為蘿卜耐鹽性遺傳改良提供重要信息。3.運(yùn)用基于iTRAQ技術(shù)的定量蛋白組學(xué)方法對(duì)鹽脅迫下(0、Na100和Na200)蘿卜肉質(zhì)根蛋白組的變化進(jìn)行分析。共在三個(gè)文庫中鑒定到6342個(gè)蛋白質(zhì),其中分別鑒定到 851 (CKvsNa100)、706 (CKvsNa200)和 685 (Na100vsNa200)個(gè)差異蛋白。功能注釋分析表明,這些差異蛋白主要參與了碳水化合物和能量代謝、蛋白質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫與抗性、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁與細(xì)胞骨架代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等過程。運(yùn)用RT-qPCR分析9個(gè)被鑒定到的蛋白相應(yīng)的基因表達(dá)水平,其中四個(gè)基因在不同濃度鹽處理下的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)改變相一致。另外,蛋白組與轉(zhuǎn)錄組、miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,共發(fā)現(xiàn)17對(duì)miRNA-mRNA-protein參與蘿卜鹽脅迫響應(yīng),并初步提出了蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S631.1

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本文編號(hào)：1307876