本文關(guān)鍵詞：帕金蛋白通過增強自噬來緩解PrP106-126引起神經(jīng)元凋亡的機制研究

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【摘要】：朊病毒病,即傳染性海綿狀腦病,是一類可以感染人類和野生動物的神經(jīng)退化性疾病。在這些疾病中,一個核心事件是正常蛋白構(gòu)象的改變,即正常朊蛋白(PrPc)從可溶的、主要為α螺旋的構(gòu)象改變?yōu)楦缓琾折疊、不可溶的、有蛋白酶抗性并具致病性和感染性的Prpsc。神經(jīng)元或核內(nèi)體中Prpsc的復(fù)制和蓄積導(dǎo)致了淀粉樣的沉積,最終導(dǎo)致細胞毒性和細胞死亡。通常,動物的朊病毒疾病包括,牛海綿狀腦病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)、綿羊和山羊的癢病、鹿和糜鹿的慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)、以及水貂的水貂傳染性腦病(Transmissible mink encephalopathy, TME)。而在人中則包括庫魯病、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、變異型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD)、致死性家族失眠癥(Fatal familial insomnia, FFI)。盡管朊病毒疾病在人類中的發(fā)生率較低,但因為其獨特生物學(xué)特性的傳染源以及其他動物朊病毒疾病對于公共衛(wèi)生健康的威脅,朊病毒疾病仍然受到人們的廣泛關(guān)注。帕金蛋白是細胞質(zhì)內(nèi)蛋白,大小為53kDa,包含465個氨基酸殘基和一個特殊的RING/HECT混合區(qū)域,這個混合區(qū)域中包括了兩種主要的E3泛素連接酶。帕金蛋白在錯誤折疊蛋白的降解中發(fā)揮著重要的作用,而且其能調(diào)節(jié)K48連接的和K63連接的泛素化,從而實現(xiàn)對于多種底物的降解。帕金蛋白的變異與隱性遺傳性少年型帕金森病(Autosomal recessive juvenile Parkinson's disease, ARJPD)相關(guān)。已有研究報道,帕金蛋白的表達減少了β樣淀粉蛋白(Ap),并下調(diào)了阿茲海默癥(AD)中淀粉樣蛋白的表達。據(jù)研究,帕金蛋白可以減輕炎癥、活性氧(ROS)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。在帕金森疾病(Parkinson's diseas, PD)中,帕金蛋白同樣可以通過啟動線粒體自噬,來調(diào)節(jié)功能異常線粒體的選擇性自噬。帕金蛋白改善自噬缺陷、增強對于自噬體以及自噬泡的清除,進而導(dǎo)致阿茲海默癥模型中Aβ的清除。在帕金蛋白中,比如多功能蛋白,具有廣泛的神經(jīng)保護功能,以應(yīng)對廣泛的神經(jīng)毒性損傷,并被用于神經(jīng)退行性疾病的治療中。迄今為止,多數(shù)帕金蛋白的相關(guān)研究都是對于帕金森疾病或者阿茲海默病的,卻幾乎沒有其在朊病毒疾病中作用的研究報道。本研究試圖研究帕金蛋白在朊病毒疾病中可能存在的保護作用,并闡述帕金蛋白調(diào)控細胞保護的機制。為了研究帕金蛋白在朊病毒疾病中的作用,我們使用了N2a細胞模型和PrP106-126朊病毒多肽片段。PrP106-126保留了Prpsc聚集成淀粉樣纖維的能力,因此,可用于體外研究朊病毒引起的細胞毒性和死亡。我們的結(jié)果顯示PrP106-126處理細胞后,細胞內(nèi)可溶性帕金蛋白水平呈現(xiàn)出平緩的、時間依賴性的減少。此外,免疫細胞學(xué)實驗顯示,內(nèi)源性的帕金蛋白與FITC標(biāo)記的106-126多肽片段存在共定位,提示二者之間的相互作用,導(dǎo)致泛素化作用從而清除PrP片段。通過pCMV-HA-Parkin質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染,在N2a細胞中對帕金蛋白進行過表達,減輕了PrP106-126引起的凋亡；應(yīng)用Annexin V FITC鑒定并量化凋亡細胞的百分比,顯示帕金蛋白過表達的細胞組相對于pCMV-HA空載體細胞組,細胞凋亡率顯著降低。同時,CCK-8的檢測也顯示,在PrP106-126處理后,pCMV-HA-Parkin表達組和空載對照組相比,細胞活力也有明顯的提升。免疫印跡法分析自噬標(biāo)志物顯示,在PrP106-126處理之后,相對于空載對照組,白噬增強。帕金蛋白的過表達,同樣降低了凋亡Bax蛋白向線粒體的轉(zhuǎn)移、細胞色素C向胞質(zhì)中的釋放,進而抑制了促凋亡的caspase 9、caspase 12和caspase 3的活性。綜上,我們的研究結(jié)果顯示,帕金蛋白對于PrP106-126引起的神經(jīng)毒性和細胞死亡是有保護作用的,而這種保護作用是通過促進自噬,減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,抑制Bax蛋白向線粒體的轉(zhuǎn)移,抑制細胞色素C的釋放從而減輕促凋亡的Caspase蛋白的活性來實現(xiàn)的。盡管,對于更深層次地揭示促進自噬并明顯調(diào)節(jié)細胞生存與死亡的因素仍需進一步的研究,但我們的研究顯示,帕金蛋白可能在朊病毒疾病中具有重要治療價值。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.3
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本文編號：1306564