發(fā)布時(shí)間：2017-12-17 23:04

  本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)及活性分析

  更多相關(guān)文章： 旋毛蟲 絲氨酸蛋白酶抑制劑 胰蛋白酶 α-糜蛋白酶 胃蛋白酶

【摘要】：旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的一種重要的食源性寄生蟲病。旋毛蟲能夠感染人、豬、犬、貓、鼠、虎、狼等150多種動(dòng)物。人感染旋毛蟲主要表現(xiàn)為發(fā)熱、肌肉酸痛、腹瀉、水腫、皮疹、代謝紊亂、出血等;還可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的并發(fā)癥;嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡�；疾�(dòng)物臨床表現(xiàn)分為腸期和肌期,腸期在病豬主要表現(xiàn)為急性卡他性腸炎,而肌期主要表現(xiàn)為病豬、病牛發(fā)生發(fā)熱、運(yùn)動(dòng)障礙、呼吸困難等全身癥狀,最后導(dǎo)致死亡;病豬耐過后,臨床癥狀可以減輕而呈帶蟲狀態(tài)。在整個(gè)生命周期中,旋毛蟲一直暴露于宿主胃、小腸的消化酶以及體液的免疫酶環(huán)境中。而證據(jù)顯示多種腸道線蟲分泌的蛋白酶抑制劑能夠減小這種宿主內(nèi)環(huán)境中消化酶對(duì)其導(dǎo)致的損傷,同時(shí),也能夠輔助寄生性線蟲吸收營(yíng)養(yǎng)并抵抗宿主的免疫反應(yīng)。而絲氨酸蛋白酶抑制劑在這些蛋白酶抑制劑中占有重要地位。絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠抑制一種或多種蛋白酶,它在動(dòng)物、植物、寄生蟲、病毒等的生存、繁殖發(fā)揮著重要作用。到目前為止,已經(jīng)從多種寄生蟲,如血吸蟲、鞭蟲、鉤蟲、絳蟲和其他寄生蟲體內(nèi)分離并鑒定了絲氨酸蛋白酶抑制劑。這些研究表明,絲氨酸蛋白酶抑制劑在保護(hù)線蟲免受宿主蛋白酶的消化作用以及與宿主相應(yīng)蛋白結(jié)合而調(diào)節(jié)宿主的免疫炎癥反應(yīng)。這些絲氨酸蛋白酶抑制劑的能夠抑制酶的活性,包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰彈性蛋白酶以及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等。根據(jù)絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列、結(jié)構(gòu)特征以及作用機(jī)制,將其分成至少18個(gè),如kunitz、kazal、Serpin、TAP以及TIL家族。本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得Tsp03044、TspAd5、Tsp03548(登錄號(hào):XM 003379333、EU263307、XM_003379851)的全長(zhǎng)序列,并采用各種生物信息學(xué)軟件對(duì)其基本理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)化地位等進(jìn)行了詳細(xì)分析。結(jié)合蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三種蛋白質(zhì)均可能是分泌蛋白,并分別具有典型的Ascaris、Serpin、Kazal型結(jié)構(gòu)域,分別屬于Ascaris、Serpin、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑;同時(shí),還根據(jù)各自家族的典型結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)了三種蛋白質(zhì)的重要的作用位點(diǎn)。另外,通過對(duì)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):三種蛋白與各自家族成員有較高的同源性,在整體的進(jìn)化分支上分別與線蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑關(guān)系較近。本研究設(shè)計(jì)并合成了擴(kuò)增Tsp0304基因的引物,由旋毛蟲成蟲基因組中擴(kuò)增出Tsp03044基因,測(cè)序正確后將其連接至載體內(nèi),構(gòu)建出帶有His6標(biāo)簽的Tsp03044原核表達(dá)載體。經(jīng)過表達(dá)條件的優(yōu)化,最終采用1 mM IPTG,18℃優(yōu)化過夜表達(dá)可溶性的Tsp03044蛋白。另外,采用1 mM IPTG,37℃進(jìn)行過夜誘導(dǎo)表達(dá)TspAd5和Tsp03548蛋白。并對(duì)其進(jìn)行可溶性蛋白的純化及脫鹽處理。本研究首先通過熒光法測(cè)定10 mM Tris-HCl中酶-底物的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光值,獲得各酶-底物反應(yīng)的初始速率,利用雙倒數(shù)法計(jì)算出酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和kcat值,進(jìn)而獲得各重組蛋白對(duì)三種酶的抑制常數(shù)Ki值。結(jié)果顯示,32 nm的Tsp03044對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶均有抑制作用,Ki值分別為10.05 nM、12.53 nM和1.21 nM;32 nm的TspAd5對(duì)α-糜蛋白酶和胃蛋白酶有抑制作用,其Ki值分別為9.85 nM和5.92 nM;而32 nm的Tsp03548對(duì)胰蛋白酶沒有抑制作用,對(duì)α-糜蛋白酶的抑制作用非常弱(Ki=139.31 nM),對(duì)胃蛋白酶具有較好的抑制效果(Ki=3.83 nM)。另外,本研究還采用分光光度法檢測(cè)了Tsp03044、TspAd5、Tsp03548分別對(duì)凝血酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G和顆粒酶B的抑制作用。本研究檢測(cè)了不同溫度下Tsp03044和TspAd5兩種抑制劑對(duì)酶-底物反應(yīng)的影響。其結(jié)果以反應(yīng)的kcat值與溫度的關(guān)系表示,顯示了不同溫度下,重組蛋白對(duì)酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率的影響。結(jié)果顯示,37℃是各反應(yīng)的最適溫度,對(duì)于胰蛋白酶來說無論溫度高于或低于37℃時(shí)酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的能力均下降;而由于抑制劑的存在,抑制了胰蛋白酶的作用,各溫度下胰蛋白酶將底物轉(zhuǎn)化的能力均較低;對(duì)于α-糜蛋白酶而言,27~42℃下酶活力均較好,但它不能耐受47℃的高溫。Tsp03044在各溫度下對(duì)α-糜蛋白酶的抑制作用均較好,而42℃時(shí)的抑制作用突然降低可能是由于測(cè)量時(shí)出現(xiàn)誤差導(dǎo)致。為了鑒定三種絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性位點(diǎn),本研究采用定點(diǎn)突變的方法制備了活性位點(diǎn)突變的重組蛋白,并檢測(cè)了各突變蛋白對(duì)胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率,結(jié)果表明各突變蛋白對(duì)胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的抑制效率均不如原蛋白,表明本研究所預(yù)測(cè)并突變的氨基酸即為該抑制劑的活性位點(diǎn)。為了檢測(cè)Tsp03044、TspAd5、Tsp03548三種抑制劑在旋毛蟲各生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)情況,本研究首先采用SYBR Green I熒光定量方法對(duì)三種基因的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè),并以18S r RNA基因?yàn)閮?nèi)參基因,通過檢測(cè)熒光定量PCR反應(yīng)的Ct值,根據(jù)ΔΔCt法計(jì)算出Tsp03044、TspAd5、Tsp03548基因相對(duì)于18S rRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示,三種抑制劑基因在旋毛蟲的成蟲及肌幼蟲時(shí)期均有表達(dá),但均在肌幼蟲時(shí)期的表達(dá)量最大,說明三種抑制劑在旋毛蟲肌幼蟲時(shí)期發(fā)揮了更大的作用。而western blot方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論。旋毛蟲Ascaris、Serpin、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑Tsp03044、TspAd5、Tsp03548的成功表達(dá)純化為檢測(cè)三種蛋白的功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ);Tsp03044、TspAd5、Tsp03548對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶和其他蛋白酶的抑制活性研究、各重組蛋白活性位點(diǎn)的鑒定以及Tsp03044、TspAd5、Tsp03548在旋毛蟲各生長(zhǎng)時(shí)期中表達(dá)量的檢測(cè)也為進(jìn)一步研究三種蛋白在保護(hù)旋毛蟲免受宿主消化酶的消化作用等功能奠定了基礎(chǔ)�？傊�,本研究結(jié)果表明Tsp03044、TspAd5、Tsp03548為有效的絲氨酸蛋白酶抑制劑,本研究結(jié)果為研究Tsp03044、TspAd5、Tsp03548基因的功能提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 蓋文燕;李文卉;張念章;曲自剛;付寶權(quán);;旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsSerpin)基因的克隆及序列分析[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2014年12期

2 胡學(xué)智;王俊;;蛋白酶生產(chǎn)和應(yīng)用的進(jìn)展[J];工業(yè)微生物;2008年04期

3 張智明;;凝血酶的研究進(jìn)展[J];海峽藥學(xué);2006年06期

4 陳曉翔;楊程德;顧越英;;纖溶酶功能研究進(jìn)展[J];診斷學(xué)理論與實(shí)踐;2005年05期

5 何智,陳政良;補(bǔ)體系統(tǒng)絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2004年06期

6 武金霞,趙曉瑜;蚯蚓纖溶酶的研究進(jìn)展及趨勢(shì)[J];中國(guó)生化藥物雜志;2004年05期

7 季星來,孫之榮;基于結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶超家族進(jìn)化分析[J];電子學(xué)報(bào);2001年S1期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳秀萍;旋毛蟲不同發(fā)育時(shí)期抗原基因的篩選與鑒定[D];吉林大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：1301872