本文關(guān)鍵詞：捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因組測(cè)序及基于轉(zhuǎn)錄組分析的捕食相關(guān)基因研究

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【摘要】：Duddingtonia flagrans是捕食線蟲性真菌的一個(gè)代表種類,強(qiáng)大的環(huán)境耐受力與捕食線蟲能力使它在動(dòng)物寄生性線蟲防治方面具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家針對(duì)Duddingtonia flagrans做了大量的研究工作,內(nèi)容貫穿形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察、生物學(xué)特性研究與臨床殺蟲效果評(píng)價(jià)。但是由于缺乏分子水平研究基礎(chǔ),直到目前,我們還無(wú)法從基因與進(jìn)化角度說(shuō)明其對(duì)線蟲的致病力與生存能力,這可能是制約捕食線蟲性真菌研究領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要原因。為此,本研究以捕食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans為研究對(duì)象,在國(guó)內(nèi)外首次對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過(guò)比較基因組學(xué)分析,揭示其基因組特征、腐生能力、致病能力、起源與進(jìn)化特點(diǎn);利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,篩選一系列與捕食線蟲功能相關(guān)的基因,并對(duì)其進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證;借助于光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡,對(duì)Duddingtonia flagrans捕食寄生性線蟲三期幼蟲過(guò)程,進(jìn)行了詳盡的觀察與描述;利用活體熒光染色技術(shù),對(duì)Duddingtonia flagrans原生質(zhì)體的制備進(jìn)行了評(píng)價(jià),為捕食線蟲相關(guān)基因的功能驗(yàn)證提供了基礎(chǔ)研究材料。主要取得的研究成果有以下幾個(gè)方面:(1)對(duì)D.flagrans基因組DNA提取方法進(jìn)行了篩選與優(yōu)化,結(jié)果表明透析膜培養(yǎng)結(jié)合柱式法提取其基因組DNA的方法簡(jiǎn)便可行,為絲狀真菌DNA提取提供了新的思路;利用低深度二代測(cè)序技術(shù),對(duì)D.flagrans的基因組概況進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果表明D.flagrans基因組大小約為37.6 Mb,GC含量為44.95%,基因組雜合度較低,可以采用常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行深度測(cè)序與組裝,該研究為D.flagrans全基因組精細(xì)圖譜繪制方案的制定提供了重要依據(jù)。(2)在對(duì)D.flagrans進(jìn)行三代高深度測(cè)序的基礎(chǔ)上,利用比較基因組學(xué)分析對(duì)D.flagrans基因組特征、腐生能力以及對(duì)線蟲的致病性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,D.flagrans基因組較小,并且缺乏重復(fù)誘導(dǎo)點(diǎn)突變機(jī)制,顯示了其緩慢的進(jìn)化速率。同時(shí),同源基因分析和基因家族分析表明D.flagrans基因組變異不明顯、保守性較強(qiáng)。致病性分析表明,D.flagrans具有豐富的潛在致病基因,這些基因在線蟲捕食過(guò)程中發(fā)揮重要作用,包括PHI基因,細(xì)胞色素P450基因,以及數(shù)量眾多的蛋白酶編碼基因。與之相反,D.flagrans中碳水化合物降解酶基因數(shù)量較少,表明D.flagrans利用碳水化合物的能力較弱,反映出D.flagrans較弱的腐生能力。(3)對(duì)捕食線蟲性真菌D.flagrans捕食馬圓線蟲屬幼蟲過(guò)程進(jìn)行了超微形態(tài)學(xué)觀察,進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)了該真菌與線蟲相互作用的過(guò)程;通過(guò)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察,將整個(gè)捕食過(guò)程劃分為三個(gè)階段,分別為捕食前(0h)、捕食中(12 h)、捕食后(48 h),不同捕食階段的劃分為后續(xù)D.flagrans轉(zhuǎn)錄組研究樣品采集工作提供了理論依據(jù),也為D.flagrans捕食相關(guān)基因的發(fā)掘奠定了理論基礎(chǔ)。(4)以D.flaagrans基因組為參考,對(duì)D.flagrans捕食線蟲的不同階段樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果表明,D.flagrans在捕食線蟲過(guò)程中,共有41.2%的基因發(fā)生差異表達(dá),其中上調(diào)表達(dá)基因有2877個(gè),下調(diào)表達(dá)基因有3269個(gè);對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析表明,在真菌捕食線蟲過(guò)程中,參與能量代謝、擴(kuò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因產(chǎn)生了顯著表達(dá),這些基因與真菌在捕食線蟲時(shí)大量分泌胞外蛋白酶以及能量的產(chǎn)生有關(guān);KEGG富集分析表明,上調(diào)基因中,次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑富集的基因數(shù)目最多,說(shuō)明次級(jí)代謝產(chǎn)物在真菌侵染線蟲過(guò)程中發(fā)揮了重要作用;下調(diào)基因中淀粉與蔗糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、過(guò)氧物酶體、碳代謝過(guò)程富集的基因數(shù)目多,說(shuō)明與真菌腐生作用相關(guān)的碳水化合物降解作用減弱;對(duì)捕食過(guò)程中分泌蛋白酶調(diào)控基因分析與前100位差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)分析表明,在真菌捕食線蟲時(shí),參與捕食功能的凝集素、幾丁質(zhì)酶、枯草桿菌蛋白酶、G蛋白偶聯(lián)受體、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞骨架構(gòu)建等相關(guān)基因等基因高水平表達(dá),而與腐生有關(guān)的碳水化合物降解酶基因呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。(5)以轉(zhuǎn)錄組分析中篩選的與捕食線蟲功能相關(guān)的基因?yàn)榛A(chǔ),挑選了其中22種對(duì)于捕食功能具有重大意義的目的基因,并進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示,11種上調(diào)表達(dá)基因與11種下調(diào)表達(dá)基因表達(dá)趨勢(shì)均符合轉(zhuǎn)錄組分析所得數(shù)據(jù),驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性,并進(jìn)一步證明了這些基因參與了D.flagran 捕食線蟲過(guò)程。(6)為了對(duì)篩選的捕食線蟲相關(guān)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,為目的基因敲除提供試驗(yàn)材料—D.flagrans原生質(zhì)體,本研究利用熒光探針CFDASE,對(duì)D.flagrans原生質(zhì)體制備情況進(jìn)行快速評(píng)估,探究了 CFDASE標(biāo)記原生質(zhì)體的最佳條件,結(jié)果顯示,CFDASE終濃度為10μmol/L、標(biāo)記時(shí)間為15 min、孵育溫度為36℃為標(biāo)記最佳條件。該結(jié)果為捕食線蟲性真菌D.flagrans原生質(zhì)體的大量制備提供了快速評(píng)價(jià)方法,為捕食相關(guān)基因功能驗(yàn)證提供了基礎(chǔ)試驗(yàn)材料。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S855.9;Q78

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2 張偉;捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因組測(cè)序及基于轉(zhuǎn)錄組分析的捕食相關(guān)基因研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1301426