發(fā)布時間：2017-12-17 09:09

  本文關(guān)鍵詞：乳酸菌預(yù)防金黃色葡萄球菌乳腺炎的機制研究

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【摘要】：金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一,它不僅給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,還對食品安全和人類健康構(gòu)成威脅。目前為止,抗生素依然是治療奶牛乳腺炎的主要手段。然而,畜牧養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用,廣泛引起耐藥菌株特別是多重耐藥菌的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致治愈率的下降。因此,尋找抗生素替代療法是防治奶牛乳腺炎的當(dāng)務(wù)之急。益生菌能夠抑制病原菌定植,被認(rèn)為是一種可能的抗生素替代品。但是,由于細(xì)菌與宿主之間或細(xì)菌與細(xì)菌之間相互作用的復(fù)雜性,益生菌的抑制機制尚不明確。本研究利用健康奶牛的乳汁為菌源,篩選益生特性好的乳酸菌菌株,利用小鼠模型,評價其對奶牛乳腺炎的預(yù)防作用,為益生菌在防治奶牛乳腺炎中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時,本論文還研究了金黃色葡萄球菌中ISSau2插入序列的特性及乳腺炎金黃色葡萄球菌中ISSau2的序列特征。取得的主要研究結(jié)果如下:1.優(yōu)良特性乳酸菌的篩選與鑒定。以健康奶牛的牛奶為菌源,利用MRS選擇性培養(yǎng)基分離得到61株乳酸菌。通過體外抑菌試驗、乳腺上皮細(xì)胞粘附試驗、抑制金黃色葡萄球菌對乳腺上皮細(xì)胞的粘附試驗、抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成試驗、牛奶中生長試驗等篩選,得到3株益生特性好的乳酸菌。這3株乳酸菌均屬于魏斯式菌屬,分別命名為LW1,LW2和LW3。隨機選取3株益生特性差的乳酸菌,命名為LS1,LS2和LS3,一并用于后續(xù)試驗的研究。2.利用小鼠乳腺模型研究乳酸菌對乳腺炎的預(yù)防作用。動物試驗采用單因素完全隨機設(shè)計,120只哺乳期母鼠隨機分為8組:陰性對照組(乳腺僅注射PBS緩沖液)、陽性對照組(乳腺僅注射金黃色葡萄球菌)、六個處理組分別先注射乳酸菌LW1,2,3,LS1,2和3,再注射金黃色葡萄球菌。結(jié)果表明,乳腺注射乳酸菌能夠顯著降低乳腺組織中金黃色葡萄球菌的數(shù)量及促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6的表達(dá)量,從而起到預(yù)防乳腺炎的效果。其中,LW1,2和3的預(yù)防效果比LS1,2和3的預(yù)防效果更加顯著。另外,還研究了乳酸菌對乳腺組織中緊密連接蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示:相比于陽性對照組,預(yù)先注射乳酸菌LW1,2和3的乳腺組織中:claudin-1基因的mRNA表達(dá)量升高,而claudin-4和7基因的mRNA表達(dá)量降低。3.研究乳酸菌預(yù)防金黃色葡萄球菌乳腺感染的分子機制。結(jié)果顯示:乳酸菌LW1,2和3的基因組中含有fbpA基因,而乳酸菌LS1,2和3中不含該基因。為了研究FbpA對乳酸菌抑制金黃色葡萄球菌乳腺感染的作用,分別構(gòu)建了fbpA基因的敲除菌株LW1?fbpA和FbpA表面展示菌株LW1?fbpA(FbpA)。首先,相比于LW1,LW1?fbpA對乳腺上皮細(xì)胞的粘附能力顯著降低(P0.05)。LW1?fbpA不能顯著地抑制金黃色葡萄球菌對乳腺上皮細(xì)胞的粘附和侵染,而LW1?fbpA(FbpA)的抑制活性與LW1無顯著差異。其次,FbpA還能夠顯著降低金黃色葡萄球菌生物膜的形成能力。最后,利用小鼠乳腺模型研究了FbpA對乳酸菌預(yù)防乳腺炎的影響。60只哺乳期母鼠隨機分為4組:陰性對照組(乳腺僅注射金黃色葡萄球菌)、陽性對照組(LW1處理組)、LW1 fbpA處理組和LW1?fbpA(FbpA)處理組。乳酸菌經(jīng)乳導(dǎo)管注射入乳腺內(nèi),2小時后感染金黃色葡萄球菌。結(jié)果顯示:對于乳酸菌抑制金黃色葡萄球菌乳腺內(nèi)定植情況而言,LW1的效果最明顯,LW1?fbpA(FbpA)次之,LW1?fbpA最差。4.研究了乳腺炎金黃色葡萄球菌中ISSau2插入序列的特性。本部分試驗首先驗證了ISSau2編碼的轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合活性,OrfAB能夠特異性結(jié)合ISSau2兩端的反向重復(fù)序列。其次,從164個乳腺炎金黃色葡萄球菌分離株中檢測到9個含有ISSau2的菌株。通過NCBI的BLAST分析,已全基因組測序的細(xì)菌中有27株金黃色葡萄球菌中含有ISSau2。根據(jù)ISSau2序列的多樣性,將發(fā)現(xiàn)的共37株含有ISSau2的金黃色葡萄球菌分為四組:GroupA、B、C和D。GroupA和C中的菌株全部來源于人,具有宿主特異性。GroupB中的ISSau2均為截短的ISSau21628,其中ST398菌株與GroupD中的LGA251的關(guān)系較近。GroupD中的菌株均為乳腺炎源金黃色葡萄球菌,具有組織特異性。綜上所述,本研究從牛奶中成功分離篩選得到3株益生特性好的乳酸菌,其利用FbpA抑制金黃色葡萄球菌對乳腺上皮細(xì)胞的粘附和侵染,通過FbpA降低金黃色葡萄球菌生物膜的形成,以減少金黃色葡萄球菌在乳腺內(nèi)的定植,從而起到減輕乳腺感染的效果。此外,還研究了ISSau2插入序列的特性以及乳腺炎金黃色葡萄球菌中ISSau2的序列特征。為進(jìn)一步研究金黃色葡萄球菌乳腺炎的預(yù)防或治療奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23

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