本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒強弱毒株感染潛伏期機體免疫應(yīng)答的差異性研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的以腦脊髓炎為特征的急性人獸共患病,在世界范圍內(nèi)均有流行,全球每年約有60,000人死于狂犬病,其中多數(shù)發(fā)生在發(fā)展中國家�？袢〔《�(RABV)宿主廣泛,可感人、犬、貓、蝙蝠、狐貍等幾乎所有的溫血動物,神經(jīng)組織嗜性是其感染的最典型特征,RABV侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)后,感染者幾乎100%發(fā)病并最終導致死亡。在動物種群中不斷傳播的狂犬病病毒野毒稱為街毒(street virus),在形成致死性感染時,無論街毒最初感染發(fā)生在機體哪個部位,最終都將通過感染局部侵入外周神經(jīng)然后逆軸突轉(zhuǎn)運至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),發(fā)生嚴重的腦脊髓炎引發(fā)動物死亡。值得注意的是,RABV并非一進入機體就直接侵入神經(jīng)系統(tǒng),而是需要經(jīng)歷少則數(shù)天,多則數(shù)月乃至數(shù)年的潛伏期,或稱隱蔽期,而后才能侵入神經(jīng)形成不可逆的致死性感染。在CNS被強毒感染之前,帶毒個體無可見的臨床癥狀和明顯的血清學反應(yīng)。換言之,在狂犬病病毒的感染潛伏期,無法從臨床表現(xiàn)和血清學反應(yīng)判斷該個體是否攜帶RABV。經(jīng)人工馴化或人為變異產(chǎn)生的對動物致病力減弱或消除的RABV屬于弱毒,弱毒株侵入機體,將在體內(nèi)停留一段時間后于感染局部被清除,如果抵達CNS,將被瞬間消滅。RABV強弱毒株產(chǎn)生完全不同的感染結(jié)局,其毒力差別是造成這一結(jié)果的初始因素,而機體針對不同毒力RABV的應(yīng)答差異則是決定感染結(jié)局的關(guān)鍵因素。闡明RABV進入機體后潛伏或 隱蔽‖的機制,對于狂犬病病毒早期感染分子標志的發(fā)現(xiàn)、干預感染、逆轉(zhuǎn)感染以及暴露后早期診斷、發(fā)病后早期治療研究都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本論文以代表性狂犬病街毒和弱毒各1株為研究對象,其中街毒株BD06系本室2006年從保定一狂犬腦內(nèi)分離得到,為中國I群(見附圖-1),代表目前我國狂犬病流行的優(yōu)勢毒株;弱毒株SRV9,源自1935年從狗分離到的SAD株,經(jīng)連續(xù)動物傳代及細胞馴化后致弱,目前已開發(fā)為疫苗株在全球多地應(yīng)用。本研究以上述狂犬病病毒街毒株及弱毒株分別感染小鼠,對感染后腦組織進行數(shù)字化基因表達差異分析(DGEs),Go富集及信號通路分析,研究街毒和弱毒株外周感染后免疫應(yīng)答的差異及差異因子涉及的通路,并對潛伏感染中差異表達的基因進行克隆,以慢病毒為載體對差異基因參與RABV感染與復制的過程進行研究,具體如下:1.數(shù)字化基因表達譜測序分析腦內(nèi)感染兩株RABV引起的免疫應(yīng)答變化。分離到的狂犬病街毒株BD06馴化后,使其適應(yīng)細胞培養(yǎng),滴度能夠穩(wěn)定達到105.875TCID50/ml,可以滿足后續(xù)的實驗要求;將18只小鼠均分3組進行腦內(nèi)感染:SRV9感染組、BD06感染組及對照組。在感染后的1dpi及6dpi進行頸部脫臼后,Rnase free條件下處理經(jīng)RNA-seq測序,對數(shù)據(jù)分析可知,病毒感染1dpi,SRV9相對于BD06感染組,出現(xiàn)528個基因顯著表達上調(diào),對其進行聚類研究表明,大部分參與固有免疫應(yīng)答信號通路,有些參與抗原呈遞過程,而BD06與對照組相比,參與免疫應(yīng)答基因基本沒有變化;病毒感染6dpi時,BD06相比較于SRV9,441個基因表達明顯上調(diào),參與炎性應(yīng)答的基因大幅提升,趨化因子表達提高,IFN表達量急劇增加,而適應(yīng)性應(yīng)答相關(guān)通路依然未被激活,細胞出現(xiàn)一種 穩(wěn)態(tài)‖失調(diào),小鼠體重下降明顯,出現(xiàn)厭食、精神沉郁、四肢癱瘓等癥狀,而此時的SRV9較感染1dpi時,應(yīng)答水平總體均有所增加,DC及B細胞活化較多,小鼠體重慢慢恢復增長,狀態(tài)也逐漸恢復正常。2.RABV Taq-Man熒光定量拷貝數(shù)方法的建立。為了研究兩株RABV感染小鼠的病毒載量動態(tài)變化,更好地揭示病毒潛伏感染與病毒復制之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián),設(shè)計基于兩株RABV定量的TaqMan探針引物,經(jīng)篩選得到最優(yōu)化的組合G2,為了消除引物與不同病毒N基因的結(jié)合差異,分別建立了針對兩株病毒的定量標準曲線,靈敏度可達101拷貝數(shù)/μl、擴增效率接近100%,線性回歸系數(shù)均在0.99以上,可以滿足對BD06及SRV9株病毒載量的測定。3.狂犬病病毒強弱毒株腦內(nèi)及外周感染小鼠免疫應(yīng)答差異的研究。因RNA-seq只選擇了病毒感染的早期和晚期進行研究,對于病毒感染的中間時間段缺乏研究,為了揭示病毒感染潛伏期應(yīng)答的全過程變化,將72只SPF級小鼠分成兩大群,第一大群36只小鼠均分三組:SRV9感染組、BD06感染組及對照組,在病毒腦內(nèi)感染后的1dpi、3dpi、5dpi及鄰近死亡(ED)時眼球靜脈叢采血、腹股溝淋巴結(jié)剝離、并在無Rnase環(huán)境下取腦組織進行RNA提取。另一大群小鼠均分三組在感染后每天進行體重稱量。研究發(fā)現(xiàn),SRV9感染組在1dpi時固有免疫應(yīng)答即被激活進而參與抑制病毒的增殖,隨著感染的進行,免疫應(yīng)答逐漸增強,同時DC及B淋巴細胞被激活,在3dpi時誘導的病毒中和抗體(VNA)已接近0.5 IU/ml,一個被認為可達保護水平的數(shù)值,血腦屏障(BBB)通透性提高,免疫應(yīng)答將病毒進行清除(病毒載量出現(xiàn)較明顯的下降),當病毒載量下降后,固有免疫應(yīng)答緩慢恢復正常,VNA對剩余RABV進行全部消除;而BD06感染組相比較對照組,在病毒潛伏的整個過程免疫應(yīng)答基本上維持不變,病毒進入腦內(nèi)維持一相對較低的 隱蔽‖狀態(tài),當病毒大量增殖時,誘導趨化因子及炎性應(yīng)答強烈,IFN分泌激增,VNA僅在ED時有極少量分泌,此時,腦內(nèi)未見明顯的病理變化,小鼠消瘦,頭部蜷縮,四肢麻痹,后肢癱瘓,機體衰竭而死亡。外周感染時,SRV9組在病毒感染早期誘導機體產(chǎn)生少量VNA,感染中期VNA可達保護性水平,進而將病毒清除,使得病毒不能進入中樞神經(jīng)(CNS),BD06感染時,感染早期逃逸機體免疫應(yīng)答,一小部分病毒傳運至腦部,潛伏一段時間后,進行大量增殖,引發(fā)趨化-炎性因子的 風暴‖應(yīng)答,而產(chǎn)生的痕量VNA無法將病毒進行清除,機體發(fā)病。4.IFITs抗RABV感染與復制的研究。為了進一步探究IFITs(IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5)對于RABV感染潛伏期的影響,以IFN誘導的293T細胞提取RNA進行擴增,克隆出IFITs,亞克隆到慢病毒表達載體pFUGW-H1中,基于二代慢病毒包裝系統(tǒng)分別拯救出表達IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5的重組病毒,隨后分別與RABV強弱毒株共感染細胞,對IFITs參與RABV感染與復制過程進行研究。綜上所述,我們比較了兩種感染途徑病毒感染潛伏過程中機體對于RABV強弱毒株的差異應(yīng)答,研究發(fā)現(xiàn),病毒一旦形成感染,SRV9能夠被RIG-I及TLR信號通路識別,誘導固有免疫應(yīng)答,從而對病毒復制進行干擾,隨后激活的適應(yīng)性免疫應(yīng)答將病毒進行清除;而BD06感染時,病毒 隱蔽‖起來,逃逸模式識別受體(PRRs)的識別,少量病毒抵達中樞神經(jīng)系統(tǒng)經(jīng)潛伏一段時間后,病毒載量出現(xiàn)急劇增加,誘發(fā)CNS的 風暴‖應(yīng)答,而此時機體產(chǎn)生的痕量VNA又不足以完全清除RABV,感染小鼠出現(xiàn)四肢癱瘓、嗜睡、共濟失調(diào)等臨床癥狀,但病理結(jié)果顯示CNS細胞結(jié)構(gòu)完好,機體衰竭死亡。細胞水平上,通過拯救出表達IFITs(IFIT1、IFIT2、IFIT3與IFIT5)的慢病毒分別與RABV共感染細胞,結(jié)果表明IFIT3能夠顯著抑制RABV的復制,同時對于弱毒SRV9抑制效果比BD06效果更明顯,而其他IFITs未檢測到對RABV感染293T細胞有影響(不具有統(tǒng)計學差異),IFIT3抑制RABV強弱毒株效果的差異對于控制RABV街毒株感染提供一潛在的靶標。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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1 劉曄;房麗君;趙敬慧;張守峰;張菲;扈榮良;;我國狂犬病流行毒株JX08-45適應(yīng)細胞培養(yǎng)后的生物學特性[J];中國生物制品學雜志;2012年09期

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本文編號：1299511