本文關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹血細(xì)胞免疫效應(yīng)因子的抗菌功能研究

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【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼動(dòng)物亞門(Crustacea)、十足目(Decapoda)、是我國(guó)東部沿海湖泊河流流域的重要經(jīng)濟(jì)物種,并得到廣泛養(yǎng)殖。近年來(lái),隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的提高,各種由細(xì)菌、真菌、螺原體或不明原因所引起的疾病不斷出現(xiàn),對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,在我國(guó)蟹類養(yǎng)殖品種中病害最為嚴(yán)重。對(duì)于中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)和免疫防御機(jī)制的理解是提高其抗病能力和研發(fā)藥物的基礎(chǔ),因此,對(duì)該物種固有免疫機(jī)制的研究刻不容緩。為了保護(hù)自身不受外來(lái)物體的侵襲,生物體發(fā)展出了強(qiáng)大的免疫系統(tǒng),并可分為適應(yīng)性免疫(adaptive immunity)和固有免疫(innate immunity)。截止目前的證據(jù)表明,適應(yīng)性免疫系統(tǒng)僅存在于脊椎動(dòng)物中,而固有免疫系統(tǒng)則在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中均存在。作為機(jī)體的第一道防線,固有免疫可以通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫這兩種方式來(lái)抵御外來(lái)病原的感染。在體液免疫中,無(wú)脊椎動(dòng)物通過(guò)溶于血淋巴或位于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRR)特異性地識(shí)別并結(jié)合病原表面包括肽聚糖(peptidoglycan, PGN)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和葡聚糖(β-glucan, GLU)在內(nèi)的多種病原模式分子(pathogen-associated molecular pattern, PAMP),并激活相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,繼而調(diào)控抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)的表達(dá)。為了深入研究中華絨螯蟹的免疫功能,本研究首先建立了一種新型的該蟹血細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)。該培養(yǎng)方法使用L-15培養(yǎng)基,在不添加血清和CO2的情況下,可以在280C條件下穩(wěn)定培養(yǎng)血細(xì)胞達(dá)到30天。為了驗(yàn)證所培養(yǎng)血細(xì)胞是否具有免疫活性,首先檢測(cè)了EsDWD1、EsLecG和EsTol12這三種免疫相關(guān)基因在不同PAMP刺激后的mRNA表達(dá)量變化,其次觀察了所培養(yǎng)血細(xì)胞在不同濃度副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)刺激下的黑化情況,最后檢測(cè)了MAPK信號(hào)通路中JNK、ERK和p38這三個(gè)信號(hào)分子的磷酸化情況。結(jié)果表明,該培養(yǎng)條件下的中華絨螯蟹血細(xì)胞具有較好的免疫活性,為其在免疫功能研究中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。已有研究表明,果蠅中不同的模式識(shí)別蛋白具有結(jié)合不同的病原微生物,并誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抗菌肽以應(yīng)對(duì)不同類型病原的現(xiàn)象,且該現(xiàn)象也在某些甲殼動(dòng)物中被證實(shí)。然而,中華絨螯蟹中是也否具有該現(xiàn)象,且特異性的免疫效應(yīng)因子有哪些卻仍然不明。為了更為深入地了解中華絨螯蟹血細(xì)胞說(shuō)分泌的免疫效應(yīng)因子是否具有病原特異性,同時(shí)為了避免其它免疫相關(guān)組織如肝胰腺分泌蛋白的干擾,我們?cè)谘?xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ),對(duì)副溶血弧菌(革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(革蘭氏陽(yáng)性菌)刺激后血細(xì)胞所分泌的胞外蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量分析,并從中篩選得到了在幾種重要的免疫效應(yīng)因子。其中包括凝血因子轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)和C型凝集素蛋白(C-type lectin, CTLD containing protein)。在之后的研究中,我們將深入研究這兩種蛋白的免疫功能。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)是一種重要的凝血因子,同時(shí)在固有免疫中還具有直接抗菌功能,然而除了凝血功能外,其在中華絨螯蟹中是否還具有其它免疫功能尚未可知。由于在iTRAQ分析的結(jié)果中TGase出現(xiàn)了明顯的上調(diào),因此非常有必要研究其免疫功能。本研究首先克隆得到了cDNA全長(zhǎng)達(dá)3248 bp的TGase (EsTGase),該基因包含一個(gè)長(zhǎng)度達(dá)到2274 bp且編碼757個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(ORF)。其編碼區(qū)含有2個(gè)transglut功能域和一個(gè)TGase/protease-like同源功能域,并含有一個(gè)KGD (Lys-Gly-Asp) motif。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,該蛋白在進(jìn)化上非常保守,可能是一種獨(dú)特且古老的蛋白。EsTGase在血細(xì)胞中表達(dá)最為豐富,在免疫刺激后,EsTGase的表達(dá)量顯著上調(diào),與iTRAQ的結(jié)果相符,表明了其可能具備的免疫功能。通過(guò)RNA干擾技術(shù)(RNAi)將EsTGase敲降后發(fā)現(xiàn),抗菌肽及免疫效應(yīng)因子的表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào),且血細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)菌CFU數(shù)量顯著上升,表明該蛋白可以通過(guò)調(diào)控抗菌肽來(lái)實(shí)現(xiàn)其免疫功能。作為一類模式識(shí)別蛋白(pattern recognition protein, PRP),C型凝集素(CTL)在固有免疫中具有識(shí)別并消除病原的重要作用。在iTRAQ的分析結(jié)果中,CTL是另一類在病原刺激后出現(xiàn)顯著上升的蛋白。本研究在血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上篩選并首先克隆得到了一個(gè)CTL基因EsLecH,發(fā)現(xiàn)該CTL能結(jié)合不同病原并直接抑制其增值的同時(shí),還能通過(guò)JNK信號(hào)通路調(diào)控抗菌肽的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)其另一方面的免疫功能。EsLecH蛋白具有一個(gè)信號(hào)肽和單一的糖類識(shí)別功能域。該基因在不同組織中均有較高表達(dá),且在免疫刺激后表達(dá)量顯著上調(diào)。通過(guò)獲得該基因的重組蛋白后的實(shí)驗(yàn)表明,EsLecH蛋白可以與不同的微生物結(jié)合,但其結(jié)合能力并不相同；Ca2+能顯著增強(qiáng)該蛋白對(duì)細(xì)菌的結(jié)合能力,但該結(jié)合能力卻不是Ca2+依賴的；該蛋白能明顯抑制與其結(jié)合能力較強(qiáng)細(xì)菌的增值。此外,敲降EsLecH后能顯著下調(diào)抗菌肽和JNK的磷酸化程度；在敲降JNK后,抗菌肽的表達(dá)同樣顯著下降,且不會(huì)隨著EsLecH重組蛋白的加入而上升,表明EsLecH可以通過(guò).JNK信號(hào)通路調(diào)控抗菌肽的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4
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本文編號(hào)：1295314