本文關(guān)鍵詞：日本沼蝦雌性性早熟相關(guān)基因的篩選、克隆、表達(dá)與功能分析

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【摘要】：日本沼蝦是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的十足目甲殼動(dòng)物,是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要種類之一。近年來(lái),由于日本沼蝦自然資源的銳減,其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,但養(yǎng)殖的日本沼蝦卻出現(xiàn)了生產(chǎn)性能下降、種質(zhì)資源不斷退化的情況,最為嚴(yán)重的是出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象。性早熟是指日本沼蝦提前進(jìn)入繁殖期,當(dāng)其尚未達(dá)到商品規(guī)格大小時(shí),性腺就已經(jīng)發(fā)育成熟,同時(shí)個(gè)體生長(zhǎng)停止,使蝦的商品率降低、產(chǎn)品貶值。性早熟的雌性個(gè)體還會(huì)產(chǎn)生低質(zhì)量的后代,這樣年復(fù)一年的繁育,加重了日本沼蝦種質(zhì)資源退化現(xiàn)象,制約了日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此對(duì)雌性日本沼蝦的性早熟現(xiàn)象進(jìn)行研究,對(duì)性早熟相關(guān)基因進(jìn)行篩選和功能分析,對(duì)闡明日本沼蝦性早熟的分子機(jī)制,解決日本沼蝦種質(zhì)資源退化問(wèn)題具有重要的意義。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法,通過(guò)差異表達(dá)分析鑒別出了性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦卵巢中的差異基因(DEGs),通過(guò)對(duì)這些DEGs的注釋、表達(dá)模式聚類分析,以及顯著富集性分析篩選出可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的基因;利用基因克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)PCR技術(shù)獲得了其中5個(gè)可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)技術(shù)檢測(cè)了這5個(gè)基因的mRNA的表達(dá)規(guī)律并利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默其表達(dá),探索了這5個(gè)基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用,獲得的主要研究成果如下:1.正常性成熟的和性早熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從正常性成熟的和性早熟的日本沼蝦的卵巢中共獲得63,336個(gè)unigenes以及大量的繁殖相關(guān)unigenes和代謝通路。鑒別出了26,008個(gè)SSRs,并分別從正常性成熟和性早熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測(cè)了80,516個(gè)和80,529個(gè)SNPs,還預(yù)測(cè)出了29,851個(gè)性早熟和正常性成熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組中之間的SNPs。首次從性早熟和正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中鑒別出了549個(gè)DEGs,包括212個(gè)上調(diào)基因和337個(gè)下調(diào)基因。另外,從這549個(gè)DEGs中鑒別出了187個(gè)正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中特異表達(dá)的DEGs和90個(gè)性早熟的日本沼蝦的卵巢中特異表達(dá)的DEGs。通過(guò)對(duì)這549個(gè)DEGs的GO分類分析、KEGG通路分析、以及GO和KEGG顯著富集性分析,鑒別出12個(gè)可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的DEGs,即卵黃蛋白原(Vg)、組織蛋白酶L(CTSL)、半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)、胰島素樣受體(INSR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)、環(huán)氧化酶(COX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gpx)、銅鋅超氧化物過(guò)氧化物酶(sod1)、脂肪酸合成酶(fasn)、二磷酸核苷激酶(nm23)、核糖體蛋白l24(rpl24)和核糖核苷還原酶調(diào)節(jié)因子1(rrm1)基因。2.性早熟相關(guān)基因的克隆及序列分析克隆出了日本沼蝦mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因全長(zhǎng)cdna序列,這5個(gè)基因的cdna全長(zhǎng)分別是829bp、564bp、3238bp、6199bp和2941bp,其orf區(qū)分別為531bp、486bp、1845bp、2709bp和2436bp,分別編碼177、162、615、903和812個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)這5個(gè)基因的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)mnnm23蛋白具有保守的ndk結(jié)構(gòu)域及ndk活性部位基序(nxxh[g/a]sd),與羅氏沼蝦的nm23(mrnm23)蛋白的氨基酸序列相似性最高;mnrpl24蛋白具有一個(gè)保守的trash結(jié)構(gòu)域,20個(gè)磷酸化位點(diǎn)和兩個(gè)典型的核定位信號(hào),不具有線粒體類型的rpl24蛋白所具有的標(biāo)簽序列,是一種細(xì)胞質(zhì)類型的核糖體蛋白;mncox具有一個(gè)明顯的egf-like結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和8個(gè)保守的對(duì)環(huán)氧化酶活性起重要作用的氨基酸殘基,其mrna的3’端非編碼區(qū)(3’utr)序列具有多個(gè)au富集元件(au-richelements,ares),其結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)與脊椎動(dòng)物的cox2最為接近;mncst氨基酸序列中含有6個(gè)cystatin-like結(jié)構(gòu)域,是一種multicystatin蛋白;mnrrm1具有第i類rr酶的大亞基所具有保守的酶活性位點(diǎn),大小亞基聚合所必須的兩個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)域,因此mnrrm1屬于第i類rr酶的大亞基。3.性早熟相關(guān)基因mrna的表達(dá)分析在日本沼蝦的受精卵、無(wú)節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦幼體、仔蝦及成蝦這6個(gè)生長(zhǎng)階段中,mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因均在受精卵中的表達(dá)量較低;在日本沼蝦的Ⅰ-Ⅵ期的卵巢中,mnnm23、mnrpl24、mncox和mnrrm1基因的表達(dá)量均在Ⅰ期卵巢中最高,而mncst基因在Ⅳ期卵巢中的表達(dá)量最高;在日本沼蝦的卵巢、肝胰腺、肌肉、心臟、腸、鰓、胃、腹神經(jīng)節(jié)和眼柄這9個(gè)組織中,mnnm23基因在日本沼蝦肝胰腺和肌肉中的表達(dá)量最高,mnrpl24和mncst基因在日本沼蝦腸中的表達(dá)量最高,mncox和mnrrm1基因在日本沼蝦鰓中的表達(dá)量最高;這5個(gè)基因在性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中的表達(dá)量均有顯著差異(p0.05)。4.性早熟相關(guān)基因的功能驗(yàn)證mnnm23基因沉默后,日本沼蝦卵巢中卵黃生成作用標(biāo)志基因vg和vgr,卵母細(xì)胞成熟標(biāo)志基因cyclinb和cdc2基因的表達(dá)水平和蝦的gsi在一個(gè)卵巢發(fā)育周期中與對(duì)照組相比提前達(dá)到峰值。mnrpl24、mncox和mnrrm1基因沉默后vg、vgr、cyclinb和cdc2基因的表達(dá)水平和蝦的gsi在一個(gè)卵巢發(fā)育周期中與對(duì)照組相比在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著下降(p0.05)。mncst基因沉默后,日本沼蝦卵巢中ctsl基因在一個(gè)卵巢發(fā)育周期的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比顯著下降(p0.05),而vg、vgr、Cyclin B和Cdc2基因的表達(dá)水平和蝦的GSI在一個(gè)卵巢發(fā)育周期中與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(P0.05)。卵巢組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)MnNM23基因沉默后日本沼蝦的卵母細(xì)胞的發(fā)育加快,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因沉默后日本沼蝦的卵母細(xì)胞的發(fā)育被延遲,而MnCST基因沉默后日本沼蝦的卵母細(xì)胞的發(fā)育不受影響。因此,MnNM23對(duì)日本沼蝦卵黃生成和卵母細(xì)胞的成熟具有負(fù)相關(guān)的作用,MnNM23基因的低表達(dá)會(huì)促進(jìn)卵巢的快速發(fā)育。MnRPL24、MnCOX和MnRRM1對(duì)日本沼蝦的卵黃生成和卵母細(xì)胞的成熟的具有正相關(guān)的作用,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因的低表達(dá)會(huì)延遲卵巢的發(fā)育。而MnCST對(duì)卵黃生成和卵母細(xì)胞的成熟沒(méi)有影響,因而對(duì)卵巢的發(fā)育也沒(méi)有影響。卵巢發(fā)育過(guò)程中,尤其是在卵巢發(fā)育早期階段,MnNM23的不足,或者是MnRPL24、MnCOX和MnRRM1的過(guò)量都有可能是導(dǎo)致日本沼蝦性早熟的一個(gè)重要的原因,但確切的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。綜上所述,本研究鑒別出了性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦卵巢的差異表達(dá)基因,并篩選出了可能的日本沼蝦性早熟相關(guān)基因。對(duì)5個(gè)可能的日本沼蝦性早熟相關(guān)基因進(jìn)行了克隆、序列分析和mRNA的表達(dá)分析。最后探索了這5個(gè)基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育過(guò)程中的作用。本研究結(jié)果將為闡明日本沼蝦性早熟的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4
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本文編號(hào)：1295275