本文關(guān)鍵詞：日本沼蝦雌性性早熟相關(guān)基因的篩選、克隆、表達與功能分析

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【摘要】：日本沼蝦是一種具有很高經(jīng)濟價值的十足目甲殼動物,是我國淡水養(yǎng)殖的主要種類之一。近年來,由于日本沼蝦自然資源的銳減,其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大,但養(yǎng)殖的日本沼蝦卻出現(xiàn)了生產(chǎn)性能下降、種質(zhì)資源不斷退化的情況,最為嚴重的是出現(xiàn)性早熟現(xiàn)象。性早熟是指日本沼蝦提前進入繁殖期,當其尚未達到商品規(guī)格大小時,性腺就已經(jīng)發(fā)育成熟,同時個體生長停止,使蝦的商品率降低、產(chǎn)品貶值。性早熟的雌性個體還會產(chǎn)生低質(zhì)量的后代,這樣年復(fù)一年的繁育,加重了日本沼蝦種質(zhì)資源退化現(xiàn)象,制約了日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此對雌性日本沼蝦的性早熟現(xiàn)象進行研究,對性早熟相關(guān)基因進行篩選和功能分析,對闡明日本沼蝦性早熟的分子機制,解決日本沼蝦種質(zhì)資源退化問題具有重要的意義。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法,通過差異表達分析鑒別出了性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦卵巢中的差異基因(DEGs),通過對這些DEGs的注釋、表達模式聚類分析,以及顯著富集性分析篩選出可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的基因;利用基因克隆和cDNA末端快速擴增(RACE)PCR技術(shù)獲得了其中5個可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的基因的全長cDNA序列,并對其序列進行了生物信息學(xué)分析;利用實時熒光定量PCR(QPCR)技術(shù)檢測了這5個基因的mRNA的表達規(guī)律并利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默其表達,探索了這5個基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育過程中的作用,獲得的主要研究成果如下:1.正常性成熟的和性早熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組測序本次轉(zhuǎn)錄組測序從正常性成熟的和性早熟的日本沼蝦的卵巢中共獲得63,336個unigenes以及大量的繁殖相關(guān)unigenes和代謝通路。鑒別出了26,008個SSRs,并分別從正常性成熟和性早熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組中預(yù)測了80,516個和80,529個SNPs,還預(yù)測出了29,851個性早熟和正常性成熟的日本沼蝦卵巢轉(zhuǎn)錄組中之間的SNPs。首次從性早熟和正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中鑒別出了549個DEGs,包括212個上調(diào)基因和337個下調(diào)基因。另外,從這549個DEGs中鑒別出了187個正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中特異表達的DEGs和90個性早熟的日本沼蝦的卵巢中特異表達的DEGs。通過對這549個DEGs的GO分類分析、KEGG通路分析、以及GO和KEGG顯著富集性分析,鑒別出12個可能與日本沼蝦性早熟相關(guān)的DEGs,即卵黃蛋白原(Vg)、組織蛋白酶L(CTSL)、半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)、胰島素樣受體(INSR)、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、環(huán)氧化酶(COX)、谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)、銅鋅超氧化物過氧化物酶(sod1)、脂肪酸合成酶(fasn)、二磷酸核苷激酶(nm23)、核糖體蛋白l24(rpl24)和核糖核苷還原酶調(diào)節(jié)因子1(rrm1)基因。2.性早熟相關(guān)基因的克隆及序列分析克隆出了日本沼蝦mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因全長cdna序列,這5個基因的cdna全長分別是829bp、564bp、3238bp、6199bp和2941bp,其orf區(qū)分別為531bp、486bp、1845bp、2709bp和2436bp,分別編碼177、162、615、903和812個氨基酸。通過對這5個基因的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)mnnm23蛋白具有保守的ndk結(jié)構(gòu)域及ndk活性部位基序(nxxh[g/a]sd),與羅氏沼蝦的nm23(mrnm23)蛋白的氨基酸序列相似性最高;mnrpl24蛋白具有一個保守的trash結(jié)構(gòu)域,20個磷酸化位點和兩個典型的核定位信號,不具有線粒體類型的rpl24蛋白所具有的標簽序列,是一種細胞質(zhì)類型的核糖體蛋白;mncox具有一個明顯的egf-like結(jié)構(gòu)域、一個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域和8個保守的對環(huán)氧化酶活性起重要作用的氨基酸殘基,其mrna的3’端非編碼區(qū)(3’utr)序列具有多個au富集元件(au-richelements,ares),其結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)與脊椎動物的cox2最為接近;mncst氨基酸序列中含有6個cystatin-like結(jié)構(gòu)域,是一種multicystatin蛋白;mnrrm1具有第i類rr酶的大亞基所具有保守的酶活性位點,大小亞基聚合所必須的兩個α-螺旋結(jié)構(gòu)域,因此mnrrm1屬于第i類rr酶的大亞基。3.性早熟相關(guān)基因mrna的表達分析在日本沼蝦的受精卵、無節(jié)幼體、蚤狀幼體、糠蝦幼體、仔蝦及成蝦這6個生長階段中,mnnm23、mnrpl24、mncox、mncst和mnrrm1基因均在受精卵中的表達量較低;在日本沼蝦的Ⅰ-Ⅵ期的卵巢中,mnnm23、mnrpl24、mncox和mnrrm1基因的表達量均在Ⅰ期卵巢中最高,而mncst基因在Ⅳ期卵巢中的表達量最高;在日本沼蝦的卵巢、肝胰腺、肌肉、心臟、腸、鰓、胃、腹神經(jīng)節(jié)和眼柄這9個組織中,mnnm23基因在日本沼蝦肝胰腺和肌肉中的表達量最高,mnrpl24和mncst基因在日本沼蝦腸中的表達量最高,mncox和mnrrm1基因在日本沼蝦鰓中的表達量最高;這5個基因在性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦的卵巢中的表達量均有顯著差異(p0.05)。4.性早熟相關(guān)基因的功能驗證mnnm23基因沉默后,日本沼蝦卵巢中卵黃生成作用標志基因vg和vgr,卵母細胞成熟標志基因cyclinb和cdc2基因的表達水平和蝦的gsi在一個卵巢發(fā)育周期中與對照組相比提前達到峰值。mnrpl24、mncox和mnrrm1基因沉默后vg、vgr、cyclinb和cdc2基因的表達水平和蝦的gsi在一個卵巢發(fā)育周期中與對照組相比在多個時間點都顯著下降(p0.05)。mncst基因沉默后,日本沼蝦卵巢中ctsl基因在一個卵巢發(fā)育周期的多個時間點與對照組相比顯著下降(p0.05),而vg、vgr、Cyclin B和Cdc2基因的表達水平和蝦的GSI在一個卵巢發(fā)育周期中與對照組相比沒有顯著差異(P0.05)。卵巢組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)MnNM23基因沉默后日本沼蝦的卵母細胞的發(fā)育加快,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因沉默后日本沼蝦的卵母細胞的發(fā)育被延遲,而MnCST基因沉默后日本沼蝦的卵母細胞的發(fā)育不受影響。因此,MnNM23對日本沼蝦卵黃生成和卵母細胞的成熟具有負相關(guān)的作用,MnNM23基因的低表達會促進卵巢的快速發(fā)育。MnRPL24、MnCOX和MnRRM1對日本沼蝦的卵黃生成和卵母細胞的成熟的具有正相關(guān)的作用,MnRPL24、MnCOX和MnRRM1基因的低表達會延遲卵巢的發(fā)育。而MnCST對卵黃生成和卵母細胞的成熟沒有影響,因而對卵巢的發(fā)育也沒有影響。卵巢發(fā)育過程中,尤其是在卵巢發(fā)育早期階段,MnNM23的不足,或者是MnRPL24、MnCOX和MnRRM1的過量都有可能是導(dǎo)致日本沼蝦性早熟的一個重要的原因,但確切的分子機制還需要進一步的深入研究。綜上所述,本研究鑒別出了性早熟的和正常性成熟的日本沼蝦卵巢的差異表達基因,并篩選出了可能的日本沼蝦性早熟相關(guān)基因。對5個可能的日本沼蝦性早熟相關(guān)基因進行了克隆、序列分析和mRNA的表達分析。最后探索了這5個基因在日本沼蝦卵巢發(fā)育過程中的作用。本研究結(jié)果將為闡明日本沼蝦性早熟的分子機制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
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本文編號：1295275