本文關鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型感染誘導PK-15細胞內質網應激與凋亡的機制研究

  更多相關文章： 豬圓環(huán)病毒2型 內質網應激 未折疊蛋白反應 凋亡 信號傳導

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關疾病(porcine circo virus-associated disease,PCVAD)的主要病原。PCV2屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬,其基因組是大小約為1.7 kb的單股共價閉合環(huán)狀DNA,包含三個主要的開放閱讀框(open reading frames, ORFs),分別編碼病毒復制相關蛋白(ORF1)、衣殼蛋白(ORF2)和凋亡相關蛋白(ORF3)。PCV2是已知感染哺乳動物的最小的病毒。病毒主要在淋巴組織中復制,造成淋巴組織消失和組織細胞浸潤,最終導致豬的免疫抑制。免疫刺激或者與其他病原共同感染能加重疾病的發(fā)生。有關PCV2致病機理的研究已有較大進展,但仍有一些重要的機制有待闡明。細胞凋亡(apoptosis)可能是PCV2感染造成淋巴組織消失的機制之一。但是凋亡究竟是病毒蛋白如ORF3或衣殼蛋白(Cap)直接導致,還是通過自噬(autophagy)或未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)間接導致并不明確。UPR、自噬和凋亡在細胞長期處于應激狀態(tài)下能通過相似的信號通路連續(xù)發(fā)生,并最終決定細胞的命運。內質網(endoplasmic reticulum, ER)在病毒的復制和成熟中起重要作用。病毒通過挾持細胞的翻譯機制在內質網腔合成大量病毒蛋白或利用內質網作為復制場所,最終導致內質網應激(ER stress)。細胞通過誘導UPR來應對應激,或通過凋亡來結束不能緩解的應激。能引起內質網應激的病毒多為RNA病毒,PCV2能否誘導內質網應激未有報道,我們推測PCV2誘導的凋亡可能與內質網應激有關。本研究旨在探明：(1)PCV2感染能否引起UPR,以及引起UPR的關鍵病毒蛋白；(2)UPR對病毒復制的影響；(3)PCV2引起細胞UPR與凋亡之間的聯(lián)系。1.PCV2感染細胞能選擇性激活UPR的PERK/eIF2a/ATF4/CHOP通路通過免疫印跡和RT-PCR檢測內質網應激標志分子GRP78和UPR三條分支PERK/eIF2α、TF6和IRE1α/XBP1,我們發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細胞和豬肺泡巨噬細胞均能上調GRP78,并選擇性激活PERK通路,ATF6和IRE1α/XBP1通路均不激活。促進細胞存活的轉錄因子ATF4和促進凋亡的CHOP蛋白在PCV2感染36-48 h后上調,同時伴隨大量病毒蛋白的產生。因此我們推測持續(xù)的PCV2感染能夠激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信號通路。利用表達病毒編碼蛋白的真核載體轉染細胞,免疫印跡結果表明,PCV2 Rep和Cap蛋白能誘導UPR的PERK通路。2.PCV2能夠利用PERK通路和分子伴侶GRP78增強其復制利用PERK通路關鍵分子的抑制劑或RNA干擾研究UPR對Cap蛋白表達和PCV2復制的影響。免疫印跡和TCID50結果表明,抑制PERK磷酸化或抑制eIF2a去磷酸化能夠顯著減少PCV2的復制(TCID50:GSK2606414:4.58 vs 2.88, P0.01; siPERK:4.53 vs 2.75, P0.01; Salubrinal:4.49 vs 2.25, P0.01),表明PCV2可能利用PERK通路幫助其復制。通過真核表達載體或藥物誘導過表達GRP78或用化學分子伴侶牛磺熊去氧膽酸處理能夠增強PCV2的復制(TCIDso：pcDNA3-GRP78:4.03 vs 5.13, P0.05; BIX:4.13 vs 5.12, P0.05; thapsigargin:2.90 vs 3.67, P0.05; TUDCA:4.20 vs 4.90, P0.05),而基因沉默GRP78則顯著降低Cap蛋白的表達和PCV2的復制(TCIDso:siGRP78:4.29 vs 2.96, P0.05)。表明內源性或外源性的伴侶分子可能幫助病毒蛋白正確折疊并促進病毒的復制。3.PCV2通過PERK/CHOP/Bcl-2通路引起細胞凋亡由內質網應激引起凋亡被認為是一些病毒的致病機理,如乙肝病毒感染；PCV2通過ORF3誘導凋亡尚有爭論。我們通過免疫印跡檢測凋亡關鍵分子,發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細胞后Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明顯下調,caspase-3發(fā)生剪切；流式細胞術和TUNEL法檢測凋亡也印證了PCV2感染能夠引起早期凋亡和DNA斷裂。通過化學分子伴侶緩解內質網應激能夠減少PCV2誘導的CHOP表達和caspase-3剪切,表明內質網應激和凋亡之間存在聯(lián)系。內質網應激造成感受器PERK的激活以及鈣離子外流可以介導內源性線粒體途徑的凋亡,信號通路最終匯集至線粒體,并激活凋亡執(zhí)行者caspase-3。之前已證實PCV2感染選擇性激活UPR的PERK途徑以及誘導Ca2+通過內質網上的IP3R受體外流至細胞質,通過化學抑制劑或RNA干擾,我們發(fā)現(xiàn)抑制PERK或IP3R能夠減輕PCV2感染誘導的凋亡。PERK下游的促凋亡分子CHOP可以通過抑制Bcl-2誘導凋亡,通過基因沉默CHOP能部分回補Bcl-2水平,說明PCV2感染可能通過PERK/eIF2a/CHOP/Bcl-2途徑引起凋亡。為進一步探明誘導凋亡的關鍵病毒蛋白,我們利用病毒編碼蛋白真核表達載體轉染細胞,結果表明Cap能夠通過PERK/eIF2α/CHOP通路誘導Bcl-2下調和caspase-3剪切,說明Cap蛋白在PCV2感染誘導UPR,繼而引起凋亡中起關鍵作用。綜上所述,本研究闡明了PCV2感染能夠誘導UPR,并通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP/Bcl-2通路和鈣離子外流誘導細胞凋亡,Cap是PCV2誘導細胞UPR和凋亡的功能蛋白。PCV2能利用PERK通路和GRP78增強其復制,說明PCV2感染早期通過調節(jié)UPR利于其在細胞內的增殖。研究結果為深入探究PCV2致病機制和探尋抗病毒藥物篩選靶點奠定了基礎。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 龔振華,尹燕博,沈廣;豬圓環(huán)病毒:一種新發(fā)現(xiàn)的病原[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年S1期

2 王麗榮;;豬圓環(huán)病毒的病原學與診斷[J];安徽農業(yè)科學;2006年06期

3 孫艷明;趙德明;;豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2006年07期

4 IGORMOROZOV,李凱年;豬圓環(huán)病毒及臨床意義[J];國外畜牧科技;1999年05期

5 馮衛(wèi);陳沫;楊曉容;聶克艷;陳靜;姜萍;楊林;劉海;顏艷;王海;;基于文獻計量法分析我國豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀[J];農技服務;2013年12期

6 王志軍;郭慧娟;李秀麗;董樹仁;鄢明華;;豬圓環(huán)病毒病原學研究進展[J];天津農業(yè)科學;2014年08期

7 ;獸藥新產品——豬圓環(huán)病毒疫苗[J];科技致富向導;2010年28期

8 段麗麗,文心田,曹三杰,馬曉平;豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2005年06期

9 丁昌春;鄭新勇;楊世興;;豬圓環(huán)病毒研究進展[J];中國動物檢疫;2006年08期

10 王慧杰;喬宏興;;豬圓環(huán)病毒河南株的分離鑒定[J];中國農學通報;2007年09期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 王東方;安春霞;劉光輝;閆若潛;吳志明;;豬圓環(huán)病毒1、2型多重PCR診斷方法建立及應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

2 馮麗麗;張改平;張麗萍;朱禮倩;李嬌;楊蘇珍;席俊;;豬圓環(huán)病毒致病機理的研究進展[A];河南省畜牧獸醫(yī)學會第七屆理事會第二次會議暨2008年學術研討會論文集[C];2008年

3 黃立平;劉長明;危艷武;陸月華;郭龍軍;溫士剛;武嘉男;吳洪麗;;檢測豬圓環(huán)病毒2型血清中和抗體阻斷ELISA方法的建立及應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

4 程榮華;劉云志;孫健;呼延含蓉;趙欣;邵洪澤;張麗媛;楊金生;;淺談豬圓環(huán)病毒研究現(xiàn)況[A];低碳經濟與科學發(fā)展——吉林省第六屆科學技術學術年會論文集[C];2010年

5 王鑫;葉賀佳;李敏;仇微紅;孫招金;梁昭平;;豬圓環(huán)病毒研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會2010年學術年會（第三屆中國獸藥大會學術論壇）論文集[C];2010年

6 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第十一次獸醫(yī)病理學、第十次動物病理生理學學術研討會論文集[C];2001年

7 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];第四屆中國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集[C];2001年

8 蘆銀華;談國蕾;陳德勝;陳溥言;;豬圓環(huán)病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒快速檢測方法的研究[A];豬的重要傳染病防治研究新成果——中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業(yè)委員會第7次學術交流會論文集[C];2002年

9 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）[C];2003年

10 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染的防治[A];現(xiàn)代化養(yǎng)豬企業(yè)經營管理研討會論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數據庫 前10條

1 臨城縣畜牧辦公室 張榮連;豬圓環(huán)病毒與肺炎混感的診治[N];河北科技報;2014年

2 江蘇省農科院獸醫(yī)所 俞正玉 林繼煌;豬圓環(huán)病毒感染[N];江蘇農業(yè)科技報;2004年

3 李凱年 譯;日本韓國發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒感染[N];中國畜牧水產報;2001年

4 記者 尹江勇;“豬圓環(huán)病毒疫苗”技術實現(xiàn)國產化[N];河南日報;2010年

5 張曉鵬　記者 李麗云;國內首創(chuàng)“豬圓環(huán)病毒新一代疫苗”研制成功[N];科技日報;2010年

6 記者 孟山　李松戰(zhàn);豬圓環(huán)病毒疫苗在洛研制成功[N];洛陽日報;2010年

7 記者 喬地　通訊員 聞亞麗;“豬圓環(huán)病毒”疫苗批準上市[N];科技日報;2010年

8 邢臺市獸醫(yī)院 邢蘭君 楊立帆;豬圓環(huán)病毒與附紅細胞體混感怎么辦[N];河北科技報;2014年

9 張曉鵬;“豬圓環(huán)病毒疫苗”全國推廣[N];農民日報;2010年

10 本報記者 喬地　通訊員 馬焱 鄭世孝;科技創(chuàng)新,走在富民強國的路上[N];科技日報;2010年

中國博士學位論文全文數據庫 前10條

1 周瑩珊;豬圓環(huán)病毒2型感染誘導PK-15細胞內質網應激與凋亡的機制研究[D];浙江大學;2016年

2 時建立;豬圓環(huán)病毒2型糖基化位點突變對病毒復制能力和致病性的影響及抗體膠體金檢測方法的建立[D];山東師范大學;2016年

3 蘆銀華;華東地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學調查及其感染性核酸的構建[D];南京農業(yè)大學;2003年

4 司興奎;豬圓環(huán)病毒2型感染對豬免疫功能影響的細胞與分子機制[D];中國農業(yè)大學;2005年

5 曲連東;豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應用[D];南京農業(yè)大學;2006年

6 華利忠;豬圓環(huán)病毒2型誘導仔豬淋巴細胞凋亡途徑的研究[D];南京農業(yè)大學;2011年

7 溫立斌;豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學研究[D];中國農業(yè)大學;2005年

8 董林;豬圓環(huán)病毒2型診斷試劑盒的研制與應用[D];吉林大學;2014年

9 朱善元;江蘇部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的檢測及其免疫接種試驗[D];南京農業(yè)大學;2008年

10 潘群興;豬圓環(huán)病毒2型感染分子診斷與防制的相關研究[D];南京農業(yè)大學;2008年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 陳冬杰;豬圓環(huán)病毒2型與豬鼻支原體共感染協(xié)同致病性研究[D];中國農業(yè)科學院;2015年

2 李麗;豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達及抗體ELISA方法的建立[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2011年

3 侯成才;豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因在畢赤酵母中的表達與復合水佐劑的研制[D];南京農業(yè)大學;2014年

4 陳福旺;豬瘟病毒感染報告細胞系和豬圓環(huán)病毒2型敏感細胞系的建立[D];吉林大學;2016年

5 陳靈艷;豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白ORF2的原核表達系統(tǒng)的研究[D];福州大學;2014年

6 張廣芳;豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的原核表達與間接ELISA檢測方法的建立及初步應用[D];西北農林科技大學;2016年

7 胡瑞麗;基于LAMP和熒光定量PCR技術的豬圓環(huán)病毒2型和豬細小病毒檢測試劑盒的研制[D];上海師范大學;2016年

8 杜文娟;表達豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構建及其生物學特性鑒定[D];中國農業(yè)科學院;2016年

9 劉杏;豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學調查及基因進化分析[D];中國農業(yè)科學院;2016年

10 呂陽;豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白多聚體形成的關鍵氨基酸位點研究[D];華中農業(yè)大學;2016年

，

本文編號：1293199