本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 豬圓環(huán)病毒2型 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白反應(yīng) 凋亡 信號傳導(dǎo)

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circo virus-associated disease,PCVAD)的主要病原。PCV2屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬,其基因組是大小約為1.7 kb的單股共價(jià)閉合環(huán)狀DNA,包含三個(gè)主要的開放閱讀框(open reading frames, ORFs),分別編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(ORF1)、衣殼蛋白(ORF2)和凋亡相關(guān)蛋白(ORF3)。PCV2是已知感染哺乳動(dòng)物的最小的病毒。病毒主要在淋巴組織中復(fù)制,造成淋巴組織消失和組織細(xì)胞浸潤,最終導(dǎo)致豬的免疫抑制。免疫刺激或者與其他病原共同感染能加重疾病的發(fā)生。有關(guān)PCV2致病機(jī)理的研究已有較大進(jìn)展,但仍有一些重要的機(jī)制有待闡明。細(xì)胞凋亡(apoptosis)可能是PCV2感染造成淋巴組織消失的機(jī)制之一。但是凋亡究竟是病毒蛋白如ORF3或衣殼蛋白(Cap)直接導(dǎo)致,還是通過自噬(autophagy)或未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)間接導(dǎo)致并不明確。UPR、自噬和凋亡在細(xì)胞長期處于應(yīng)激狀態(tài)下能通過相似的信號通路連續(xù)發(fā)生,并最終決定細(xì)胞的命運(yùn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)在病毒的復(fù)制和成熟中起重要作用。病毒通過挾持細(xì)胞的翻譯機(jī)制在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔合成大量病毒蛋白或利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為復(fù)制場所,最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。細(xì)胞通過誘導(dǎo)UPR來應(yīng)對應(yīng)激,或通過凋亡來結(jié)束不能緩解的應(yīng)激。能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的病毒多為RNA病毒,PCV2能否誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未有報(bào)道,我們推測PCV2誘導(dǎo)的凋亡可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。本研究旨在探明：(1)PCV2感染能否引起UPR,以及引起UPR的關(guān)鍵病毒蛋白；(2)UPR對病毒復(fù)制的影響；(3)PCV2引起細(xì)胞UPR與凋亡之間的聯(lián)系。1.PCV2感染細(xì)胞能選擇性激活UPR的PERK/eIF2a/ATF4/CHOP通路通過免疫印跡和RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78和UPR三條分支PERK/eIF2α、TF6和IRE1α/XBP1,我們發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞均能上調(diào)GRP78,并選擇性激活PERK通路,ATF6和IRE1α/XBP1通路均不激活。促進(jìn)細(xì)胞存活的轉(zhuǎn)錄因子ATF4和促進(jìn)凋亡的CHOP蛋白在PCV2感染36-48 h后上調(diào),同時(shí)伴隨大量病毒蛋白的產(chǎn)生。因此我們推測持續(xù)的PCV2感染能夠激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信號通路。利用表達(dá)病毒編碼蛋白的真核載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,免疫印跡結(jié)果表明,PCV2 Rep和Cap蛋白能誘導(dǎo)UPR的PERK通路。2.PCV2能夠利用PERK通路和分子伴侶GRP78增強(qiáng)其復(fù)制利用PERK通路關(guān)鍵分子的抑制劑或RNA干擾研究UPR對Cap蛋白表達(dá)和PCV2復(fù)制的影響。免疫印跡和TCID50結(jié)果表明,抑制PERK磷酸化或抑制eIF2a去磷酸化能夠顯著減少PCV2的復(fù)制(TCID50:GSK2606414:4.58 vs 2.88, P0.01; siPERK:4.53 vs 2.75, P0.01; Salubrinal:4.49 vs 2.25, P0.01),表明PCV2可能利用PERK通路幫助其復(fù)制。通過真核表達(dá)載體或藥物誘導(dǎo)過表達(dá)GRP78或用化學(xué)分子伴侶�；切苋パ跄懰崽幚砟軌蛟鰪�(qiáng)PCV2的復(fù)制(TCIDso：pcDNA3-GRP78:4.03 vs 5.13, P0.05; BIX:4.13 vs 5.12, P0.05; thapsigargin:2.90 vs 3.67, P0.05; TUDCA:4.20 vs 4.90, P0.05),而基因沉默GRP78則顯著降低Cap蛋白的表達(dá)和PCV2的復(fù)制(TCIDso:siGRP78:4.29 vs 2.96, P0.05)。表明內(nèi)源性或外源性的伴侶分子可能幫助病毒蛋白正確折疊并促進(jìn)病毒的復(fù)制。3.PCV2通過PERK/CHOP/Bcl-2通路引起細(xì)胞凋亡由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起凋亡被認(rèn)為是一些病毒的致病機(jī)理,如乙肝病毒感染；PCV2通過ORF3誘導(dǎo)凋亡尚有爭論。我們通過免疫印跡檢測凋亡關(guān)鍵分子,發(fā)現(xiàn)PCV2感染PK-15細(xì)胞后Bcl-2家族的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL明顯下調(diào),caspase-3發(fā)生剪切；流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測凋亡也印證了PCV2感染能夠引起早期凋亡和DNA斷裂。通過化學(xué)分子伴侶緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠減少PCV2誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)和caspase-3剪切,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡之間存在聯(lián)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造成感受器PERK的激活以及鈣離子外流可以介導(dǎo)內(nèi)源性線粒體途徑的凋亡,信號通路最終匯集至線粒體,并激活凋亡執(zhí)行者caspase-3。之前已證實(shí)PCV2感染選擇性激活UPR的PERK途徑以及誘導(dǎo)Ca2+通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R受體外流至細(xì)胞質(zhì),通過化學(xué)抑制劑或RNA干擾,我們發(fā)現(xiàn)抑制PERK或IP3R能夠減輕PCV2感染誘導(dǎo)的凋亡。PERK下游的促凋亡分子CHOP可以通過抑制Bcl-2誘導(dǎo)凋亡,通過基因沉默CHOP能部分回補(bǔ)Bcl-2水平,說明PCV2感染可能通過PERK/eIF2a/CHOP/Bcl-2途徑引起凋亡。為進(jìn)一步探明誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵病毒蛋白,我們利用病毒編碼蛋白真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,結(jié)果表明Cap能夠通過PERK/eIF2α/CHOP通路誘導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和caspase-3剪切,說明Cap蛋白在PCV2感染誘導(dǎo)UPR,繼而引起凋亡中起關(guān)鍵作用。綜上所述,本研究闡明了PCV2感染能夠誘導(dǎo)UPR,并通過PERK/eIF2α/ATF4/CHOP/Bcl-2通路和鈣離子外流誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Cap是PCV2誘導(dǎo)細(xì)胞UPR和凋亡的功能蛋白。PCV2能利用PERK通路和GRP78增強(qiáng)其復(fù)制,說明PCV2感染早期通過調(diào)節(jié)UPR利于其在細(xì)胞內(nèi)的增殖。研究結(jié)果為深入探究PCV2致病機(jī)制和探尋抗病毒藥物篩選靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 龔振華,尹燕博,沈廣;豬圓環(huán)病毒:一種新發(fā)現(xiàn)的病原[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2000年S1期

2 王麗榮;;豬圓環(huán)病毒的病原學(xué)與診斷[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年06期

3 孫艷明;趙德明;;豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2006年07期

4 IGORMOROZOV,李凱年;豬圓環(huán)病毒及臨床意義[J];國外畜牧科技;1999年05期

5 馮衛(wèi);陳沫;楊曉容;聶克艷;陳靜;姜萍;楊林;劉海;顏艷;王海;;基于文獻(xiàn)計(jì)量法分析我國豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀[J];農(nóng)技服務(wù);2013年12期

6 王志軍;郭慧娟;李秀麗;董樹仁;鄢明華;;豬圓環(huán)病毒病原學(xué)研究進(jìn)展[J];天津農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年08期

7 ;獸藥新產(chǎn)品——豬圓環(huán)病毒疫苗[J];科技致富向?qū)?2010年28期

8 段麗麗,文心田,曹三杰,馬曉平;豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2005年06期

9 丁昌春;鄭新勇;楊世興;;豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展[J];中國動(dòng)物檢疫;2006年08期

10 王慧杰;喬宏興;;豬圓環(huán)病毒河南株的分離鑒定[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王東方;安春霞;劉光輝;閆若潛;吳志明;;豬圓環(huán)病毒1、2型多重PCR診斷方法建立及應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

2 馮麗麗;張改平;張麗萍;朱禮倩;李嬌;楊蘇珍;席俊;;豬圓環(huán)病毒致病機(jī)理的研究進(jìn)展[A];河南省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第七屆理事會第二次會議暨2008年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 黃立平;劉長明;危艷武;陸月華;郭龍軍;溫士剛;武嘉男;吳洪麗;;檢測豬圓環(huán)病毒2型血清中和抗體阻斷ELISA方法的建立及應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

4 程榮華;劉云志;孫健;呼延含蓉;趙欣;邵洪澤;張麗媛;楊金生;;淺談豬圓環(huán)病毒研究現(xiàn)況[A];低碳經(jīng)濟(jì)與科學(xué)發(fā)展——吉林省第六屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2010年

5 王鑫;葉賀佳;李敏;仇微紅;孫招金;梁昭平;;豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會生物制品學(xué)分會中國微生物學(xué)會獸醫(yī)微生物學(xué)專業(yè)委員會2010年學(xué)術(shù)年會（第三屆中國獸藥大會學(xué)術(shù)論壇）論文集[C];2010年

6 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會第十一次獸醫(yī)病理學(xué)、第十次動(dòng)物病理生理學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2001年

7 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];第四屆中國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2001年

8 蘆銀華;談國蕾;陳德勝;陳溥言;;豬圓環(huán)病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒快速檢測方法的研究[A];豬的重要傳染病防治研究新成果——中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業(yè)委員會第7次學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2002年

9 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（上）[C];2003年

10 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染的防治[A];現(xiàn)代化養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)營管理研討會論文集[C];2004年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 臨城縣畜牧辦公室 張榮連;豬圓環(huán)病毒與肺炎混感的診治[N];河北科技報(bào);2014年

2 江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所 俞正玉 林繼煌;豬圓環(huán)病毒感染[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2004年

3 李凱年 譯;日本韓國發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒感染[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

4 記者 尹江勇;“豬圓環(huán)病毒疫苗”技術(shù)實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化[N];河南日報(bào);2010年

5 張曉鵬　記者 李麗云;國內(nèi)首創(chuàng)“豬圓環(huán)病毒新一代疫苗”研制成功[N];科技日報(bào);2010年

6 記者 孟山　李松戰(zhàn);豬圓環(huán)病毒疫苗在洛研制成功[N];洛陽日報(bào);2010年

7 記者 喬地　通訊員 聞亞麗;“豬圓環(huán)病毒”疫苗批準(zhǔn)上市[N];科技日報(bào);2010年

8 邢臺市獸醫(yī)院 邢蘭君 楊立帆;豬圓環(huán)病毒與附紅細(xì)胞體混感怎么辦[N];河北科技報(bào);2014年

9 張曉鵬;“豬圓環(huán)病毒疫苗”全國推廣[N];農(nóng)民日報(bào);2010年

10 本報(bào)記者 喬地　通訊員 馬焱 鄭世孝;科技創(chuàng)新,走在富民強(qiáng)國的路上[N];科技日報(bào);2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周瑩珊;豬圓環(huán)病毒2型感染誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

2 時(shí)建立;豬圓環(huán)病毒2型糖基化位點(diǎn)突變對病毒復(fù)制能力和致病性的影響及抗體膠體金檢測方法的建立[D];山東師范大學(xué);2016年

3 蘆銀華;華東地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)調(diào)查及其感染性核酸的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

4 司興奎;豬圓環(huán)病毒2型感染對豬免疫功能影響的細(xì)胞與分子機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

5 曲連東;豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 華利忠;豬圓環(huán)病毒2型誘導(dǎo)仔豬淋巴細(xì)胞凋亡途徑的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 溫立斌;豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 董林;豬圓環(huán)病毒2型診斷試劑盒的研制與應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2014年

9 朱善元;江蘇部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的檢測及其免疫接種試驗(yàn)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 潘群興;豬圓環(huán)病毒2型感染分子診斷與防制的相關(guān)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳冬杰;豬圓環(huán)病毒2型與豬鼻支原體共感染協(xié)同致病性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 李麗;豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達(dá)及抗體ELISA方法的建立[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2011年

3 侯成才;豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)與復(fù)合水佐劑的研制[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 陳福旺;豬瘟病毒感染報(bào)告細(xì)胞系和豬圓環(huán)病毒2型敏感細(xì)胞系的建立[D];吉林大學(xué);2016年

5 陳靈艷;豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白ORF2的原核表達(dá)系統(tǒng)的研究[D];福州大學(xué);2014年

6 張廣芳;豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的原核表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

7 胡瑞麗;基于LAMP和熒光定量PCR技術(shù)的豬圓環(huán)病毒2型和豬細(xì)小病毒檢測試劑盒的研制[D];上海師范大學(xué);2016年

8 杜文娟;表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

9 劉杏;豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及基因進(jìn)化分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

10 呂陽;豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白多聚體形成的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

，

本文編號：1293199