本文關(guān)鍵詞：馬精子保存技術(shù)及精子凍融損傷機(jī)制的研究

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【摘要】：馬作為一種主要的大家畜,曾經(jīng)與人類(lèi)生產(chǎn)生活息息相關(guān),機(jī)械工業(yè)興起后,馬的役用價(jià)值弱化,逐漸淡出人們生活。近些年,隨著我國(guó)人民生活水平的提高,以產(chǎn)品、文化休閑為主的現(xiàn)代馬業(yè)在我國(guó)悄然興起,現(xiàn)代馬業(yè)的發(fā)展迫切需要采用人工授精的方式進(jìn)行馬匹改良,精液的體外保存是目前我國(guó)馬匹人工授精推廣應(yīng)用過(guò)程中的技術(shù)瓶頸,本研究針對(duì)這一問(wèn)題,開(kāi)展了馬精液低溫和冷凍保存技術(shù)的研究。并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用同位素標(biāo)記定量技術(shù)(i TRAQ)探索馬精液凍融后受胎率低的原因及精子凍融損傷機(jī)制。取得結(jié)果如下:(1)分別以INRA82和INRA96?作為基礎(chǔ)稀釋液,比較6.5、6.7、6.9、7.1、7.3和7.5 p H下保存精液1、24、48和72h后對(duì)精液活力的影響,結(jié)果表明馬精子體外存活的適宜p H為6.9-7.3之間。當(dāng)p H低于6.7或高于7.3時(shí)對(duì)精液體外保存不利。用同樣方法研究公馬個(gè)體間是否存在適宜p H差異,結(jié)果表明4匹公馬精液體外存活的適宜p H均為6.9-7.3。(2)不同平衡時(shí)間、冷凍方法及解凍程序?qū)豪鋬鲂Ч难芯勘砻?精液冷凍前平衡120 min、180 min和240 min三組精液凍融后活力、質(zhì)膜完整性顯著高于0、45、90 min及過(guò)夜平衡組(P0.05);距離液氮面高度2cm和4cm熏蒸法獲得的冷凍效果與程序冷凍儀相當(dāng);采用高溫快速解凍法(75℃,7s和46℃,20s)比常規(guī)方法(37℃,30s)可獲得更高的凍后精液活力。(3)不同精清濃度對(duì)精液低溫及冷凍效果影響研究表明,30%和40%精清濃度組精液保存后精液活力顯著低于0%、10%和20%精清濃度組(P0.05),10%精清濃度組精液保存24 h后活精子比例顯著高于0%和20%精清濃度組(P0.05),但保存至96 h后精液活精子比例顯著低于0%精清濃度組(P0.05);不同濃度精清對(duì)精液冷凍效果的影響表明,含0%濃度精清組精子凍融效果最好,隨著精清濃度的增加凍融后精液活力、質(zhì)膜完整性、高線(xiàn)粒體膜電勢(shì)率逐步遞減(P0.05)。(4)比較5種抗凍劑,包括甘油、乙二醇、二甲基亞砜、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺及抗凍劑組合對(duì)馬精液冷凍效果的影響。結(jié)果表明3.5%濃度的甘油和2.5%、3.5%及5%甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺凍后精液活力顯著高于2.5%濃度的甘油和2.5%、3.5%及5%乙二醇和二甲基亞砜(P0.05);比較甘油、甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺三種抗凍劑不同組合對(duì)馬精液冷凍效果的影響,結(jié)果表明甘油和甲基甲酰胺兩種抗凍劑組合能顯著的提高冷凍效果(P0.05)。(5)比較添加不同濃度的卵黃成分(全卵黃、卵黃漿蛋白、LDL及卵黃可溶性蛋白)、大豆卵磷脂及β-環(huán)糊精膽固醇對(duì)馬精液冷凍效果的影響。結(jié)果表明卵黃漿蛋白、LDL及卵黃可溶性蛋白三種卵黃組分均對(duì)精液冷凍保護(hù)有顯著作用,但不同卵黃組分間效果無(wú)顯著差異;添加低濃度(1%)的大豆卵磷脂精液凍融后活力與對(duì)照組(4%全卵黃組)無(wú)顯著差異(P0.05),但添加高濃度大豆卵磷脂(2%和4%)組凍融后精液活精子比例、前向運(yùn)動(dòng)精子比例均顯著低于對(duì)照組(P0.05);添加不同濃度的β環(huán)糊精膽固醇組解凍后精液活力與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。(6)比較單獨(dú)或組合添加葡萄糖、果糖、乳糖、棉籽糖及海藻糖對(duì)馬精液低溫保存和冷凍效果的影響。結(jié)果表明:單獨(dú)添加乳糖和棉籽糖低溫保存24 h后精液活精子比例和前向運(yùn)動(dòng)精子比例顯著低于單獨(dú)葡萄糖、果糖及海藻糖組(P0.05),葡萄糖、果糖及海藻糖組間無(wú)顯著差異;葡萄糖和乳糖分別與其他幾種糖兩兩組合低溫保存1、24、48、72、96 h后精液質(zhì)量無(wú)顯著差異;單獨(dú)添加棉籽糖精液凍融后活精子比例和前向運(yùn)動(dòng)精子比例顯著低于果糖和海藻組(P0.05),但精液質(zhì)膜完整性和線(xiàn)粒體膜電勢(shì)卻顯著高于其他各組(P0.05);單獨(dú)添加葡萄糖、果糖、海藻糖及乳糖精液凍融后活精子比例、前向運(yùn)動(dòng)精子比例及線(xiàn)粒體膜電勢(shì)均無(wú)顯著差異(P0.05),添加果糖組凍融后精液質(zhì)膜完整性顯著低于葡糖組(P0.05);不同糖組合精液凍融后,乳糖+葡萄糖+海藻糖組精液質(zhì)膜完整性顯著高于乳糖+果糖、乳糖+海藻糖、乳糖+葡萄糖+果糖和乳糖+海藻糖+果糖組(P0.05),乳糖+果糖組精液質(zhì)膜完整性顯著低于除乳糖+海藻組外的其他各組(P0.05)。乳糖+葡萄糖+果糖組精液線(xiàn)粒體膜電勢(shì)顯著高于乳糖+果糖組(P0.05),與其他各組間無(wú)顯著差異。(7)探索用酪蛋白酸鈉和乳清粉替代天然奶成分配置馬精液保存稀釋液的可行性。結(jié)果表明兩種基礎(chǔ)稀釋液同時(shí)添加乳清粉和酪蛋白酸鈉低溫保存48h后精液活力均顯著高于對(duì)照組(P0.05),表明乳清粉和酪蛋白酸鈉對(duì)對(duì)精液低溫保存有效;在去除天然奶成分的INRA82基礎(chǔ)液中添加0.1g/m L濃度的乳清粉和0.4g/m L的酪蛋白酸鈉可獲得最佳的精液保存效果;精液冷凍實(shí)驗(yàn)證實(shí)用乳清粉和酪蛋白酸替代INRA82稀釋液中的奶成分添加卵黃和抗凍劑后配置的冷凍液獲得了比商品液更好的冷凍效果。(8)分別比較了谷氨酰胺、甘氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸、維生素C、維生素E、褪黑素8種抗氧化對(duì)馬精液低溫和冷凍保存效果的影響,結(jié)果表明添加25m M牛磺酸顯著改善了精液低溫保存后精液活力;添加Ve和甲硫氨酸組精子凍后線(xiàn)粒體完整性顯著高于對(duì)照組,添加甲硫氨酸和甘氨酸組精子凍后質(zhì)膜完整性有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.055),相反添加2.5m M半胱氨酸則不利于精液低溫或冷凍保存。(9)比較添加不同濃度(0.1、1、10、100μg/m L)準(zhǔn)噶爾小胸鱉甲抗凍蛋白對(duì)馬精液冷凍效果的影響。結(jié)果表明,添加1μg/m L濃度昆蟲(chóng)抗凍蛋白顯著改善了凍融后馬精液活力和質(zhì)膜完整性,但添加更高濃度100μg/m L的抗凍蛋白則對(duì)馬精液冷凍有害。(10)采用自制稀釋液進(jìn)行精液低溫保存或冷凍后受胎驗(yàn)證并進(jìn)行大群推廣驗(yàn)證。結(jié)果表明用自制液低溫保存精液配種后情期受胎率為67.4%,進(jìn)口INRA96?稀釋液配種后情期受胎率為57.7%,兩者無(wú)顯著差異。自制冷凍稀釋精液凍后活力在0.3以上,情期受胎率達(dá)到了50%,能夠滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。低溫保存稀釋液推廣應(yīng)用601匹馬,情期受胎率達(dá)到了63.39%。(11)利用同位素標(biāo)記定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantization,i TRAQ)檢測(cè)精子凍融前后蛋白表達(dá)差異,并對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,揭示精子凍融損傷機(jī)制。每組樣本設(shè)置兩個(gè)重復(fù)樣本,質(zhì)譜分析后得到的數(shù)據(jù)用Mascot 2.2軟件在Uniprot_equuscaballus_28004數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行數(shù)據(jù)搜索。共鑒定到2073個(gè)蛋白,以變化倍率±1.5倍,P0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白,3個(gè)比較組分別篩選出了112(凍精/鮮精)、90(半衰凍精/凍精)和128(半衰凍精/鮮精)個(gè)差異蛋白。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S821
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本文編號(hào)：1293169