發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 11:10

  本文關(guān)鍵詞：表皮生長(zhǎng)因子參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的研究

  更多相關(guān)文章： 鵝 卵泡發(fā)育 顆粒細(xì)胞 表皮生長(zhǎng)因子 細(xì)胞增殖

【摘要】：研究表明,動(dòng)物卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟及其獨(dú)特的等級(jí)排卵是在生殖激素和一系列生長(zhǎng)因子的精確調(diào)控下進(jìn)行的,EGF作為一種關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子參與了雞、人及大鼠等動(dòng)物原始卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)以及卵泡發(fā)育、成熟的調(diào)節(jié)。而鵝作為一種產(chǎn)蛋量低,且呈季節(jié)性繁殖的家禽,其卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟是否也受生殖激素和一系列生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié),目前尚未見(jiàn)有報(bào)道。本研究在開(kāi)展鵝卵泡發(fā)育過(guò)程形態(tài)組織學(xué)研究的基礎(chǔ)上,深入探討了EGF參與FSH介導(dǎo)鵝顆粒細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。為探討鵝卵泡發(fā)育過(guò)程中各級(jí)卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,通過(guò)組織形態(tài)學(xué)方法對(duì)鵝卵泡發(fā)生發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了研究。與開(kāi)產(chǎn)前期相比,產(chǎn)蛋期鵝卵巢重量迅速增加,生長(zhǎng)有5或6個(gè)等級(jí)卵泡(依體積從大到小命名為F1、F2...F5或F6)和等級(jí)前卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF)。進(jìn)入就巢期后不同等級(jí)的卵泡出現(xiàn)閉鎖,卵泡基本停止發(fā)育,卵巢出現(xiàn)萎縮和退化。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,就巢鵝閉鎖卵泡邊界不清晰,失去完整結(jié)構(gòu)。在產(chǎn)蛋期內(nèi),LYF顆粒細(xì)胞厚度達(dá)22.18μm,當(dāng)進(jìn)入等級(jí)發(fā)育后顆粒細(xì)胞厚度變薄,F1時(shí)期顆粒細(xì)胞厚度僅為12.53 μm；在等級(jí)前卵泡階段,膜細(xì)胞層緩慢增厚,SWF時(shí)期膜層厚度僅為40.61μm,進(jìn)入等級(jí)發(fā)育以后膜細(xì)胞層厚度迅速增加,F4時(shí)期達(dá)到308.30μm,增加到原來(lái)的7.7倍。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對(duì)各級(jí)卵泡內(nèi)激素及生長(zhǎng)因子含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在卵泡發(fā)育過(guò)程之中FSH出現(xiàn)了2個(gè)峰值(SYF、F2時(shí)期的FSH濃度分別為59.24 mIU/mg、46.06 mIU/mg), LH也與FSH表現(xiàn)出相似的趨勢(shì),但在LYF、F4時(shí)期出現(xiàn)峰值；而P4和E2在卵泡等級(jí)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),且在LWF、SWF時(shí)期明顯高于其他時(shí)期(P0.05)。對(duì)各級(jí)卵泡的EGF含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明在卵泡由等級(jí)前向等級(jí)卵泡發(fā)育過(guò)程中,在SYF和LYF時(shí)期顯著高于其他發(fā)育時(shí)期(P0.05),分別達(dá)68.65 pg/mg和46.73 pg/mg。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,EGF及其受體EGFR在SYF時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最高,分別為F1時(shí)期的10.17倍和5.87倍,總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。由上可以看出,在鵝卵泡發(fā)育過(guò)程中,其形態(tài)結(jié)構(gòu)、FSH與LH等生殖激素以及EGF含量發(fā)生了顯著變化,其中SYF時(shí)期是發(fā)生變化的關(guān)鍵階段。為進(jìn)一步闡明EGF和FSH對(duì)鵝等級(jí)前卵泡發(fā)育及卵泡顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。通過(guò)選取SYF分離顆粒細(xì)胞培養(yǎng),比較不同濃度EGF (0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)和FSH (0 mIU/mL、25 mIU/mL、50 mIU/mL和100 mIU/mL)對(duì)鵝顆粒細(xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGF和FSH聯(lián)合作用對(duì)鵝等級(jí)前卵泡顆粒細(xì)胞有促增殖作用,在EGF(濃度為10 ng/mL)和FSH(濃度為50 mIU/mL)共同處理下,顆粒細(xì)胞增殖效果顯著(P0.05)。分離鵝等級(jí)前卵泡進(jìn)行體外懸浮培養(yǎng),經(jīng)EGF (10 ng/mL)和FSH (50 mIU/mL)單獨(dú)或者共同處理24 h后,顆粒細(xì)胞層和膜細(xì)胞層均增厚,當(dāng)兩者共同處理時(shí),SYF顆粒細(xì)胞層厚度和膜細(xì)胞層厚度分別增加4.16 μm,8.36 μm (P0.05)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在EGF和FSH共同作用下,顆粒細(xì)胞中抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)量上升12倍(P0.05),促凋亡基因Bax表達(dá)量下降了3倍(P0.05)。由此可以看出,EGF可促進(jìn)鵝卵泡顆粒細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡,而且在FSH存在的情況下,這種作用進(jìn)一步加強(qiáng)。為探討EGF對(duì)參與顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因Smad4表達(dá)水平的影響,首先克隆了鵝Smad4基因(Genbank登錄號(hào)：KU363745),發(fā)現(xiàn)了其一種可變剪接形式Smad4-b (Genbank登錄號(hào)：KU363746),經(jīng)過(guò)比對(duì),發(fā)現(xiàn)第5外顯子完全缺失。RT-qPCR檢測(cè)顯不,Smad4基因的2種剪接形式在下丘腦,垂體,卵巢,輸卵管等繁殖組織中都有表達(dá),并以Smad4-a(野生型)為主(P0.01),且組織豐度依次為：輸卵管卵巢垂體下丘腦。顆粒細(xì)胞經(jīng)EGF處理后,Smad4-a的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。為進(jìn)一步探討產(chǎn)蛋鵝與就巢鵝卵巢miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響。選取產(chǎn)蛋期和就巢期鵝卵巢基質(zhì)組織,采用Solexa深度測(cè)序技術(shù)對(duì)產(chǎn)蛋鵝和就巢鵝卵巢組織差異miRNA進(jìn)行測(cè)序,共獲得了353條差異表達(dá)的miRNA,相對(duì)于產(chǎn)蛋鵝卵巢,有127條miRNAs在就巢鵝卵巢表達(dá)上調(diào),126條miRNAs表達(dá)下調(diào)。GO注釋和KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)的miRNA參與了激素的分泌、再生過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)EGF或FSH處理后,miR-26b、miR-27a、miR-27b等miRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.01), miR-22、miR-27c、miR-34基因表達(dá)下調(diào)。差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),Smad4即為miR-26b候選靶基因之一,趨勢(shì)與miR-26b相反。推測(cè)EGF參與鵝顆粒細(xì)胞增殖很可能依賴(lài)于miR-26b靶向于Smad4來(lái)實(shí)現(xiàn)的。上述結(jié)果表明,以上關(guān)鍵miRNA在EGF介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。總之,本研究分析了產(chǎn)蛋鵝卵巢卵泡發(fā)育的形態(tài)學(xué)圖譜,測(cè)定了卵泡內(nèi)關(guān)鍵激素以及因子的濃度,探究EGF和FSH互作對(duì)鵝體外培養(yǎng)卵泡以及顆粒細(xì)胞的作用,并探討了EGF參與卵泡顆粒細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因Smad4及關(guān)鍵候選miRNAs表達(dá)調(diào)控研究,上述研究結(jié)果將有助于全面了解EGF參與鵝生殖調(diào)控過(guò)程分子機(jī)制,為未來(lái)提高鵝繁殖力,壯大鵝產(chǎn)業(yè)提供一定的理論支撐。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S835

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陸玲,黃為一,袁生,樊慶笙;鈣在粟酒裂殖酵母細(xì)胞增殖過(guò)程中的效應(yīng)[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

2 闞飛;孫捷;田路e，

本文編號(hào)：1274237