發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 22:16

  本文關(guān)鍵詞：番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)、復(fù)蘇及機(jī)制研究

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【摘要】：番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)是我國(guó)重要的檢疫性有害生物,引起的細(xì)菌性潰瘍病嚴(yán)重影響番茄制種業(yè)和大田生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。本論文根據(jù)細(xì)菌受逆境脅迫可進(jìn)入“有活力但不可培養(yǎng)”(Viable but nonculturable, VBNC)狀態(tài)的理論,設(shè)計(jì)了與番茄生產(chǎn)中使用銅制劑防治細(xì)菌病害、種子收獲過(guò)程中使用酸處理等相關(guān)的對(duì)病原菌構(gòu)成逆境脅迫的條件,系統(tǒng)研究了番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)及復(fù)蘇條件,并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量PCR的方法,對(duì)番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的機(jī)制進(jìn)行了探索,期望為解析番茄潰瘍病菌在逆境條件下的生存策略及進(jìn)一步探明田間病害的初侵染來(lái)源提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：1)建立了基于SYTO 9/碘化丙啶(PI)染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合平板計(jì)數(shù)的方法,應(yīng)用于VBNC狀態(tài)Cmm的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)Cmm的最佳計(jì)數(shù)范圍為105-107 cell/ml;選用SYTO 9對(duì)Cmm進(jìn)行染色,染料終濃度為50 μM,染色時(shí)間為30 min,檢測(cè)通道為FL1,電壓為640 V；選用P1對(duì)Cmm死菌進(jìn)行染色,染料終濃度為150μM,染色時(shí)間為60 min,檢測(cè)通道為FL2,電壓為625 V；流式細(xì)胞儀的FSC電壓模式為E00, SSC電壓為440 V,放大模式為L(zhǎng)og型,進(jìn)樣速度為中速,激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。2)證實(shí)了Cmm在寡營(yíng)養(yǎng)的條件下,受低濃度銅離子和溫和的酸性條件誘導(dǎo)可加速進(jìn)入VBNC狀態(tài)。在含有0.05 μM、0.5μM、5 μM和50.00 μM硫酸銅的0.85%氯化鈉溶液中,Cmm分別在誘導(dǎo)37 d、1 d、1 d和2h后,有活力的菌體全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)；在pH3.5、pH4.5和pH 5.5的0.85%氯化鈉溶液中,Cmm分別在誘導(dǎo)3 d、35 d和107 d后,有活力的菌體全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)；在不添加銅離子且pH為中性的0.85%氯化鈉溶液中,有活力的Cmm在約110 d后方可全部進(jìn)入VBNC狀態(tài)。在試驗(yàn)范圍內(nèi)銅離子濃度越高或pH值越低,Cmmm進(jìn)入VBNC狀態(tài)的速度越快。3) VBNC狀態(tài)的Cmm可通過(guò)去除體系中的誘導(dǎo)因素、添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或?qū)⑵浣臃N到寄主植株等方法進(jìn)行復(fù)蘇,恢復(fù)可培養(yǎng)性,菌體在復(fù)蘇后致病力得到恢復(fù)。在VBNC誘導(dǎo)體系中添加終濃度為誘導(dǎo)使用銅離子濃度1.5倍的EDTA,可以使50州銅離子誘導(dǎo)2 h、5μM銅離子誘導(dǎo)8h和1d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；添加0.1×LB液體培養(yǎng)基可以使50 pM和5μM銅離子誘導(dǎo)1 d以及pH 3.5誘導(dǎo)11 d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；添加5%的番茄幼苗勻漿培養(yǎng)基可以使5μM銅離子誘導(dǎo)1d和5d以及pH 3.5誘導(dǎo)11d的VBNC狀態(tài)Cmmm復(fù)蘇。Cmm的LB培養(yǎng)液的上清液可以使50μM銅離子誘導(dǎo)1d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；接種寄主番茄幼苗的方法可以使50μM銅離子誘導(dǎo)2 h、1 d、2 d、3 d,5μM銅離子誘導(dǎo)1d,以及0.5 pM銅離子誘導(dǎo)4d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇。上述復(fù)蘇后得到的菌體接種番茄幼苗后,均具有致病性。4)利用RNA-Seq技術(shù)研究了Cmm形成及維持VBNC狀態(tài)的機(jī)制,通過(guò)qPCR對(duì)sigH等16個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行了驗(yàn)證,并利用突變體初步探索了sigH和katA在VBNC狀態(tài)Cmm中的功能。受銅離子脅迫5min-10d后,Cmm中有114個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào),38個(gè)基因表達(dá)量顯著下調(diào)。Cmm在銅離子脅迫下進(jìn)入并維持VBNC狀態(tài)的過(guò)程涉及到龐大的調(diào)控網(wǎng)路,σ因子(sigH)及MarR等與重金屬脅迫相關(guān)蛋白家族起到了重要的調(diào)控作用,抗銅基因(如CMM_1035、 CMM_1037)、壓力脅迫相關(guān)基因(如CMM 0581、CMM_0737)、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)基因(如CMM_1809、CMM_465)等眾多基因行使重要功能,細(xì)胞壁形成相關(guān)的多個(gè)基因(如CMM_2638)表達(dá)水平發(fā)生顯著變化,雖有較活躍的能量和物質(zhì)代謝,但細(xì)胞分裂相關(guān)基因(如CMM_0842、CMM_0012)受到抑制,細(xì)菌可維持活性但失去可培養(yǎng)性。katA的敲除使Cmm生長(zhǎng)速率變慢,但對(duì)銅離子脅迫的反應(yīng)與親本菌株無(wú)顯著差異；sigH的敲除使Cmm進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間延遲,對(duì)銅離子脅迫更敏感,推測(cè)sigH在Cmm的VBNC狀態(tài)形成中起到了重要作用。本論文首次針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性植物病原細(xì)菌開(kāi)展VBNC的相關(guān)研究,并率先對(duì)植物病原細(xì)菌VBNC狀態(tài)的機(jī)制進(jìn)行了探索,研究結(jié)果對(duì)于豐富植物病原細(xì)菌生理學(xué)的理論體系,探明VBNC狀態(tài)細(xì)菌作為田間番茄潰瘍病可能的初侵染來(lái)源、改進(jìn)檢疫性植物病原細(xì)菌檢測(cè)方法和病害綜合治理具有重要的參考價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S436.412

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本文編號(hào)：1272050