本文關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析

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【摘要】：甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育系Rs1046A和FM195A是從Yi3A轉(zhuǎn)育而來(lái)的顯性核不育系。前人的遺傳分析研究顯示,該不育系統(tǒng)的育性受到同一位點(diǎn)的三個(gè)復(fù)等位基因控制,這3個(gè)復(fù)等位基因分別為Bn MS5a(恢復(fù)基因),BnMS5b(不育基因)和BnMS5c(正�？捎蚺R保系基因),且3個(gè)等位基因之間的顯隱性關(guān)系為BnMS5aBnMS5bBnMS5c。為了闡明顯性核不育的機(jī)制,我們通過(guò)圖位克隆的方法獲得了育性調(diào)控基因BnMS5。之后,對(duì)Bn MS5的表達(dá)模式、起源進(jìn)化和不同等位基因的功能分化進(jìn)行了詳細(xì)的分析。結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法研究顯示,BnMS5a可能通過(guò)調(diào)節(jié)減數(shù)分裂染色體的濃縮使染色體維持正常的結(jié)構(gòu),從而保證減數(shù)分裂的順利完成。主要研究結(jié)果如下:1.恢復(fù)基因BnMS5a的克隆通過(guò)篩選一個(gè)包含目的等位基因BnMS5a和BnMS5b的BAC文庫(kù),獲得了BnMS5位點(diǎn)的物理圖譜。結(jié)合之前研究獲得的包含BnMS5c區(qū)段的序列,根據(jù)甘藍(lán)型油菜參考基因組信息,對(duì)標(biāo)記BE10和SCD8間的序列進(jìn)行注釋,比對(duì)不同等位基因的序列信息,選擇其中一個(gè)在三個(gè)復(fù)等位基因中序列均有差異的基因作為候選基因。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)確定來(lái)自于恢復(fù)系中的BnaA08g25920D可以恢復(fù)不育系的育性,即為目的等位基因BnMS5a。2.BnMS5等位基因的序列分析三個(gè)復(fù)等位基因的序列比對(duì)分析顯示,BnMS5a和BnMS5c在編碼區(qū)序列差異較小,僅有18個(gè)氨基酸的差異,但啟動(dòng)子區(qū)序列一致性僅為56.1%,差異極大。BnMS5b則為BnMS5a在第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)內(nèi)MULE類轉(zhuǎn)座子插入造成的功能缺失突變。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),BnMS5編碼一個(gè)功能未知的十字花科蕓薹屬特異蛋白,其N端有一個(gè)預(yù)測(cè)的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域,C端為一個(gè)DUF626結(jié)構(gòu)域。3.顯性核不育材料FM195A的染色體形態(tài)觀察染色體展片結(jié)果觀察FM195A減數(shù)分裂各時(shí)期染色體的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn),細(xì)線期后染色體的形態(tài)開(kāi)始異常,染色體不能正常凝集而是相互靠近形成緊實(shí)的一團(tuán),減數(shù)分裂過(guò)程在細(xì)線期到偶線期的轉(zhuǎn)換過(guò)程中停滯。4.BnMS5在減數(shù)分裂過(guò)程中的功能研究45S、5SrDNA和pAtT4探針熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示,FM195A中同源染色體在減數(shù)分裂偶線期不能正常配對(duì),沒(méi)有觀察到端粒的花束狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,FM195A中γH2AX信號(hào)與FM195B基本相同,表明DSB可正常形成;減數(shù)分裂染色體軸向元件關(guān)聯(lián)蛋白ASY1可正常定位到FM195A染色體上,說(shuō)明減數(shù)分裂前期I早期染色體蛋白軸的組裝過(guò)程基本正常。而黏著蛋白(cohesin蛋白)SYN1及聯(lián)會(huì)復(fù)合體中央元件重要組分ZYP1的定位受到嚴(yán)重影響,表明MS5是減數(shù)分裂特異的聯(lián)會(huì)復(fù)合體組裝所必需的;同時(shí),HEI10信號(hào)也沒(méi)有定位到突變體染色體上,表明MS5也是減數(shù)分裂同源重組所需的。5.BnMS5的表達(dá)分析qRT-PCR結(jié)果顯示,BnMS5a和BnMS5c在油菜花蕾,莖和葉中均有表達(dá)。利用RNA原位雜交和GUS染色技術(shù),我們檢測(cè)了BnMS5a在油菜花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期以及擬南芥各個(gè)組織中的表達(dá)狀況。RNA原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示,BnMS5a在花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥壁以及小孢子母細(xì)胞中可檢測(cè)到信號(hào)。GUS染色結(jié)果表明,BnMS5a在擬南芥各個(gè)組織中均有表達(dá),其在花藥中的表達(dá)模式與原位雜交的結(jié)果基本一致。BnMS5b由于在第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)座子的插入,使得基因的表達(dá)量顯著下降,RNA剪切異常,可以確定,BnMS5b是一個(gè)功能缺失基因型。轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)分析顯示,MS5a的表達(dá)量最高,MS5c次之,MS5b最低。6.BnMS5基因的起源和進(jìn)化分析分離白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中的同源基因發(fā)現(xiàn),在油菜中除BnMS5外,還有兩個(gè)同源基因:BnMS5-COPY2和BnMS5-COPY3。進(jìn)化樹(shù)和序列一致性分析表明BnMS5的兩個(gè)有功能的等位基因BnMS5a和BnMS5c來(lái)源于白菜,而兩個(gè)同源基因則來(lái)源于甘藍(lán)。該基因只在蕓薹屬特異存在,是一個(gè)進(jìn)化上新近產(chǎn)生的蕓薹屬特異的孤兒基因。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S565.4
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本文編號(hào)：1271990