本文關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹泛素連接酶Cullin家族的結(jié)構(gòu)分析及Cullin4對精子發(fā)生的作用機理研究

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【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又名河蟹,是一種季節(jié)性繁殖物種,河蟹作為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟物種,其特有的雄性生殖發(fā)育規(guī)律和精子保護體系為我們提供了很好的研究模型。研究中華絨螯蟹分子生物學(xué)的調(diào)控機制能直接的解析精子發(fā)生過程中精子質(zhì)量控制的機理,為闡明甲殼動物的生殖調(diào)控機制和人工受精技術(shù)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)意義。本論文重點關(guān)注并研究泛素化蛋白酶體途徑中的E3泛素連接酶CRLs對中華絨螯蟹精子發(fā)生的分子調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)泛素化在控制多種細胞生理過程中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控包括細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和分化等幾乎所有的生命過程。關(guān)于CRLs在中華絨螯蟹的雄性生殖發(fā)育,尤其是Cullin基因如何參與調(diào)控精子發(fā)生過程的相關(guān)研究未見報道。結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,采用分子克隆、精巢組織細胞培養(yǎng)、組織學(xué)分析、熒光定量PCR、蛋白印跡、免疫印跡等多種分子學(xué)手段對中華絨螯蟹Cullin基因進行以下六個方面的研究：(1)通過HE染色并顯微鏡下觀察中華絨螯蟹精子發(fā)生不同時期的形態(tài)學(xué)并根據(jù)生殖細胞在生精小管占的優(yōu)勢比例將其進行分類：5-6月(精原細胞期)；7-8月(精母細胞期)：9-10月(精細胞期)；11-12月(精子期)：4月開始,進入休止期。(2)成功體外培養(yǎng)中華絨螫蟹精巢組織觀察精子形成的形態(tài)學(xué)變化,其精子形成主要由三個階段構(gòu)成,早期,中期和后期。(3)本課題結(jié)合中華絨螯蟹的精巢轉(zhuǎn)錄組(-2.31 Gb)和基因組(～439.3 Gb),發(fā)現(xiàn)Cullin家族在中華絨螯蟹一共存在5個Cullin基因,分別是Cull, Cul2, Cul3, Cul4和Cul5,并獲得cDNA全長。(4)通過MrBayes構(gòu)建分子進化樹并發(fā)現(xiàn)Cullin家族在系統(tǒng)進化中具有高度的保守性。(5)實時熒光定量PCR分析Cullin家族具有相似的組織表達模式。(6)進一步探究Cullin4口何調(diào)控中華絨螯蟹的精子發(fā)生過程,其主要的調(diào)控機制如下：以增殖細胞核抗原PCNA為內(nèi)源性蛋白分子Marker來研究Cullin參與調(diào)控中華絨螯蟹的精子發(fā)生。PCNA是一類高度保守的36-KDa核蛋白,在細胞周期各個時期均有表達,在S期達到最高值,參與DNA復(fù)制、損傷修復(fù)等多種細胞過程。研究發(fā)現(xiàn)Cu14與P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢發(fā)育不同時期的表達趨勢一致,即在精母細胞期(八月)表達量最高,隨著精子發(fā)育成熟而降低。為了闡明這一現(xiàn)象的原因,我們體外培養(yǎng)精巢組織細胞,然后通過添加NAE酶抑制劑MLN4924來觀察底物蛋白P21,P27蛋白的積累情況。我們研究了抑癌基因P53、及研究已經(jīng)證實的以Cu14為支架蛋白的CRLs泛素連接酶E3的特異性識別底物即細胞周期負調(diào)控因子P21和P27與Cu14的表達差異。MLN4924是最新研究發(fā)現(xiàn)的一種高度選擇性NEDD8活化酶NAE的小分子抑制劑,能夠抑制Cullin Neddylation,控制依賴于CRLs酶的泛素化途徑,引起相關(guān)底物蛋白的積累,最終誘導(dǎo)細胞凋亡,衰老和自噬。我們通過添加濃度為1μM/LNAE酶抑制劑MLN4924,發(fā)現(xiàn)細胞周期負調(diào)控因子P21在細胞培養(yǎng)36-48小時后,P27蛋白在24-36小時過程中都有較大程度的積累,相比對照組DMSO。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時,就會誘發(fā)抑癌基因P53的表達量升高,從而刺激下游的蛋白激酶(CDK)負調(diào)控因子P21的轉(zhuǎn)錄水平升高,而P21除能抑制蛋白激酶CDK的激酶活性,從而在細胞周期進程中發(fā)揮重要作用,此外還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結(jié)合,直接抑制DNA的合成。P53通過誘導(dǎo)不能修復(fù)的受損的生殖細胞凋亡來自發(fā)控制精子質(zhì)量。P21、P27作為CRL4的底物蛋白隨后會相應(yīng)地被泛素化蛋白酶體途徑降解,從而維持細胞周期的動態(tài)平衡。由于進化方面的保守性,Cu14可能還以相似的模式調(diào)控其它物種的生殖發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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1 王元麗;中華絨螯蟹泛素連接酶Cullin家族的結(jié)構(gòu)分析及Cullin4對精子發(fā)生的作用機理研究[D];華東師范大學(xué);2016年

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本文編號：1265539