本文關(guān)鍵詞：畜禽糞便厭氧發(fā)酵過程中抗生素抗性基因變化機(jī)理研究

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【摘要】：抗生素抗性基因(ARGs)作為一種新型環(huán)境污染物,其危害在于可以通過水平基因轉(zhuǎn)移使致病菌獲得抗性,從而導(dǎo)致抗生素失效,嚴(yán)重威脅人類健康。抗生素和重金屬作為飼料添加劑被大量用于規(guī)�；B(yǎng)殖業(yè),導(dǎo)致畜禽糞便成為抗生素、重金屬和ARGs的重要儲存庫。厭氧發(fā)酵是畜禽糞便資源化利用的處理途徑之一,發(fā)酵產(chǎn)物沼液沼渣的農(nóng)用是ARGs進(jìn)入環(huán)境的重要途徑。本文用實驗室模擬的方法研究了畜禽糞便殘留的抗生素和重金屬、發(fā)酵參數(shù)(溫度、含固量)以及添加劑對厭氧發(fā)酵過程和產(chǎn)物中ARGs的影響,分析了ARGs、移動基因元件(MGEs)和微生物群落的關(guān)系,以期揭示不同因素影響ARGs變化的微生物學(xué)機(jī)理。取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:(1)高溫厭氧發(fā)酵使牛糞中8/10的ARGs豐度顯著降低,其中5/10個降幅達(dá)1.0log以上,低溫和中溫厭氧發(fā)酵中分別僅有4個和5個ARGs豐度降低。低溫和中溫厭氧發(fā)酵過程中ARGs和微生物群落變化相似,均與高溫處理差異較大。此外,高溫厭氧發(fā)酵可殺滅潛在致病菌,但其他處理中仍有殘留。微生物群落演替是造成不同溫度厭氧發(fā)酵過程中ARGs和整合子基因差異的主要原因。高溫厭氧發(fā)酵通過降低攜帶ARGs的嗜常溫細(xì)菌(Bacteroidetes和Proteobacteria)豐度從而降低ARGs豐度。厭氧發(fā)酵可通過降低整合子基因好氧宿主菌(Actinomycetales和Bacilli)的豐度以達(dá)到降低整合子基因的效果。綜合考慮,高溫厭氧發(fā)酵可被用以處理畜禽糞便以降低發(fā)酵產(chǎn)物環(huán)境風(fēng)險。(2)與液態(tài)厭氧發(fā)酵相比,固態(tài)厭氧發(fā)酵對ARGs和MGEs有更好的去除效果。尤其是中溫固態(tài)厭氧發(fā)酵,顯著降低了牛糞中5/10個ARGs和4個MGEs豐度,降幅分別為0.47 0.86 log和0.16 1.03 logs。中溫固態(tài)厭氧發(fā)酵處理對ARGs去除效果最佳,主要是由于其中與ARGs和MGEs呈顯著正相關(guān)關(guān)系的Clostridium XII豐度較低,且與ARGs呈極顯著負(fù)相關(guān)的Sphaerochaeta和Petrimonas豐度較高。與液態(tài)厭氧發(fā)酵不同,高溫固態(tài)厭氧發(fā)酵未表現(xiàn)出對ARGs和MGEs有更高去除率。整合子基因和ISCR1對固態(tài)厭氧發(fā)酵過程中ARGs的水平轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用。ARGs和MGEs的潛在宿主菌中62.5%屬于Firmicutes,且不同TS厭氧發(fā)酵處理中ARGs的差異主要由微生物群落差異造成。(3)恩諾沙星的添加使厭氧發(fā)酵過程中sul1、aac(6')-ib-cr和int I2的相對豐度顯著升高,且使發(fā)酵產(chǎn)物中int I1的相對豐度升高了0.86 0.90 log。這可能是由于恩諾沙星的添加對微生物形成選擇性壓力,從而提高了整合子和ARGs豐度。恩諾沙星對微生物群落的影響從第15天開始顯現(xiàn),主要表現(xiàn)為恩諾沙星處理中與ARGs呈極顯著正相關(guān)關(guān)系的Methanosarcina豐度顯著高于CK處理。至發(fā)酵結(jié)束時,恩諾沙星對微生物群落的影響消失。ARGs圖譜的變化主要受微生物群落演替、pH和NO_3~--N的影響。ARGs與整合子的潛在宿主菌主要屬于Firmicutes、Actinobacteria和Euryarchaeota,int I1對添加恩諾沙星牛糞厭氧發(fā)酵過程中ARGs的水平轉(zhuǎn)移起重要作用。(4)由于阿散酸具有促生長和控制疾病的作用,豬糞中通常殘留高濃度阿散酸,因此本文比較了3個濃度阿散酸(0、325和650 mg/kg干豬糞)對厭氧發(fā)酵過程中ARGs和微生物群落的影響。高濃度阿散酸的添加使發(fā)酵產(chǎn)物中tet C、sul2、erm B和gyrA的豐度升高了2倍以上。冗余分析表明微生物群落結(jié)構(gòu)的變化是導(dǎo)致ARGs圖譜變化的主要驅(qū)動因素。Network分析表明ARGs的大部分宿主菌屬Firmicutes和Proteobacteria,重金屬砷抗性基因arsC與4個ARGs和int I1共存,可能是導(dǎo)致高濃度阿散酸條件下ARGs豐度升高的原因。高濃度阿散酸會增加厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中ARGs的環(huán)境風(fēng)險,因此阿散酸作為飼料添加劑的使用應(yīng)受到監(jiān)管與控制。(5)20 g/L生物炭的添加降低了發(fā)酵產(chǎn)物中tet W、tet X、sul2、qnrA、qnrS、aac(6')-ib-cr、erm X和總ARGs的相對豐度,且使發(fā)酵過程中ISC R1豐度低于CK處理。5 g/L生物炭的添加降低了發(fā)酵產(chǎn)物中5/13 ARGs的相對豐度。生物炭的添加對厭氧發(fā)酵過程微生物群落產(chǎn)生了一定影響,20 g/L生物炭影響大于5 g/L處理。ARGs潛在宿主菌主要為Firmicutes,且生物炭主要通過影響Firmicutes和Proteobacteria豐度對ARGs圖譜產(chǎn)生影響。ARGs圖譜的次要影響因素為MGEs,其中int I2對添加生物炭厭氧發(fā)酵系統(tǒng)ARGs的傳播擴(kuò)散起重要作用,其次為ISCR1。綜上所述,高溫液態(tài)厭氧發(fā)酵通過降低中溫宿主菌豐度從而降低ARGs豐度,高固體含量更有利于MGEs的削減,20 g/L生物炭的添加有利于厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中四環(huán)素類和喹諾酮類ARGs豐度的降低。恩諾沙星和重金屬As通過對微生物形成選擇性壓力,提高發(fā)酵產(chǎn)物ARGs豐度,因此應(yīng)加強(qiáng)恩諾沙星和阿散酸在畜禽養(yǎng)殖業(yè)使用量的監(jiān)管。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.796;X713

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本文編號：1265182