本文關(guān)鍵詞：小麥抗條銹病基因Yr41的精細定位和兩個條銹菌誘導(dǎo)表達基因的功能研究

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【摘要】：小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici)引起的葉部真菌病害,是世界性的小麥病害,在中國尤為嚴重,嚴重危害小麥產(chǎn)量與品質(zhì)。培育抗病小麥品種是防治條銹病的有效方法,但隨著條銹菌新生理小種的不斷出現(xiàn),特別是V26新小種的出現(xiàn),致使大部分抗病小麥品種喪失抗性。通過對抗病基因緊密連鎖的分子標記開發(fā)和精細定位,為抗病基因的克隆、分子標記輔助育種和多基因聚合的持久抗性品種培育奠定基礎(chǔ),對小麥抗條銹病遺傳育種研究具有理論和實踐價值。小麥抗病防御反應(yīng)是多基因參與的調(diào)控過程,通過對抗條銹病調(diào)控基因的克隆與表達特性分析,探討這些基因在抗條銹病防御反應(yīng)中的作用機理,為闡明寄主與條銹菌間互作的分子機理提供科學(xué)依據(jù)。本研究以抗條銹病基因Yr41載帶的小麥抗病品種川農(nóng)19(CN19)為研究材料,通過構(gòu)建的CN19/MY11遺傳連鎖作圖群體及其高代重組自交系,進行了條銹菌CRY32接種下的作圖群體單株抗病性鑒定和遺傳分析；采用比較基因組分析和BSA-RNA-Seq測序方法,進行了EST-STS和SNP引物的開發(fā)和標記篩選,繪制Yr41基因的精細連鎖遺傳圖；利用實時熒光定量PCR(Q-RT-PCR)與病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)的技術(shù),對已克隆的條銹菌誘導(dǎo)表達基因TaLHY和TaNIT,進行了基因表達特性與功能研究,主要研究結(jié)果如下：1.配制了小麥品種CN19/MY11雜交F_1、F_2、F_(2：3)代研究群體,進行了抗條銹病遺傳分析,進一步明確了小麥品種CN19中含有的Yr41基因是一個顯性的成株期抗條銹病基因；構(gòu)建了含3212個單株的CN19/MY11雜交F_2代遺傳作圖群體及其高代重組自交系,通過小麥2BS上公布的EST序列,設(shè)計了127個EST-STS分子標記引物,利用F_(2：3)分離群體分組法(BSA)對該EST-STS引物進行篩選,共獲得了8對與Yr41基因基因緊密連鎖的分子標記,通過Kosambi函數(shù)計算與目的基因的連鎖關(guān)系：BE444541-BE474133-BE604911-Yr41-BE446068-BE444659-BF478477-BI479116-BE496167,分子標記間相對遺傳距離分別為0.83、0.19、0.06、0.19、0.06、0.44、0.19與0.32cM,使Yr41基因兩邊連鎖標記距離由8.9cM縮短至0.25cM,最小標記達到0.06 cM,將Yr41基因進一步定位在小麥2BS3-0.84-1.00區(qū)段內(nèi)。2.通過Blast本地化程序?qū)⒕o密連鎖的8條EST序列與小麥基因組草圖以及短柄草、水稻和玉米基因組進行同源關(guān)系分析,根據(jù)同源基因位點,共設(shè)計201個分子標記,但篩選結(jié)果顯示這些分子標記與Yr41沒有連鎖關(guān)系。通過生物信息學(xué)方法對這8條EST序列對應(yīng)的基因注釋結(jié)果顯示,近共分離的EST序列BE604911注釋信息為THO復(fù)合體,該蛋白在擬南芥中證實為植物抗病防御的關(guān)鍵蛋白,可作為Yr41的候選基因進一步研究。3.通過對重組自交系(RIL)F_6代中抗病和感病兩個表現(xiàn)型50(純抗)+50(純感)樣本組進行BSA-RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組高通量測序,共得到57.14Gb Clean Data。利用生物信息方法對這些數(shù)據(jù)進行分析,共計注釋約1.5萬個小麥新基因,在抗病和感病兩個表現(xiàn)型樣本組中篩選到5919個差異表達基因。對BSA群體進行SNP位點的關(guān)聯(lián)定位分析,在2BS染色體上尋找到52個SNP位點,其中有38個SNP位點設(shè)計出四引物擴增受阻突變體系引物。通過對作圖群體單株DNA的PCR產(chǎn)物檢測,共計發(fā)現(xiàn)4個SNP位點與Yr41緊密連鎖,他們與目的基因的連鎖關(guān)系為3523042/2963-3523042/3033-5186704/3797-Yr41-5245446/8902,其中3523042/2963、3523042/3033與5186704/3797分子標記與目的基因的遺傳距離為0.06 cM,5245446/8902分子標記的遺傳距離為0.25cM,增加了Yr41所在區(qū)段的密度。4.對TaLHY基因的表達和功能研究結(jié)果初步證明了該基因調(diào)控和參與小麥的穗生長與抗條銹病的防御反應(yīng)過程；發(fā)現(xiàn)TaLHY是小麥晝夜節(jié)律基因,具有白天上調(diào)表達,夜晚下調(diào)表達量特性。利用實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示,TaLHY基因主要在小麥葉、穗與莖組織中表達,根部表達較少；外源激素SA能極顯著的誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達。在拔節(jié)期對抗病小麥CN19進行VIGS基因沉默,發(fā)現(xiàn)TaLHY沉默植株無法抽穗,對條銹菌生理小種條中32親和互作表現(xiàn)感病(IT=4)。5.利用VIGS方法對克隆的TaNIT(晴水解酶)進行基因沉默研究,發(fā)現(xiàn)抗病植株沉默和未沉默植株的生長和對條銹菌應(yīng)答反應(yīng)無明顯變化。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.121.42

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本文編號：1263666