本文關(guān)鍵詞：miR-378a-3p、miR-107和相關(guān)circRNA調(diào)控牛肌細胞發(fā)育的機制研究

  更多相關(guān)文章： 秦川牛 肌肉發(fā)育 circRNA mi R-378a-3p HDAC4

【摘要】：肌肉發(fā)育是影響產(chǎn)肉量及肉品質(zhì)的重要因素之一,肌肉發(fā)育主要依賴于肌細胞增殖、分化。肌細胞增殖、分化過程涉及多基因的表達、信號傳導及網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控,受到眾多因素的調(diào)節(jié)。盡管肌肉發(fā)育的分子機制一直是發(fā)育生物學的重點研究對象,但至今為止仍然有相當數(shù)量的肌發(fā)生調(diào)節(jié)因子有待鑒定。miRNA是組織當中存在的主要的小RNA,長度約為18~24 nt的單鏈小分子RNA,由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Drosha和Dicer兩種核糖核酸酶III蛋白加工而成。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在肌肉發(fā)育中有重要的調(diào)控作用,且關(guān)于miRNA的研究主要集中在調(diào)控下游靶基因方面,對影響miRNA自身表達水平的因素研究較少,而關(guān)于牛肌肉發(fā)育中miRNA的研究更少,且調(diào)控機制仍不清楚。另有報道環(huán)狀RNA可作為miRNA分子海綿調(diào)控miRNA發(fā)揮功能,但牛肌肉中是否存在circ RNA,且功能如何還未見報道。因此,本研究以高通量測序為基礎(chǔ)分析牛肌肉組織中miRNAs及circRNAsO7表達,通過超表達、干擾手段,利用實時熒光定量PCR、雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)、CCK-8、Ed U法、流式細胞儀檢測法等技術(shù),研究了miRNAs、circRNAsO7在肌肉細胞增殖、分化中的作用機制,及circ RNA與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系,構(gòu)建關(guān)于circ RNA-miRNA-m RNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),揭示牛肌肉發(fā)育調(diào)控機制,為秦川牛分子育種提供新的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.miR-378a-3p通過靶基因HDAC4調(diào)控肌細胞增殖、分化及凋亡從前期秦川牛骨骼肌miRNAs高通量測序結(jié)果中鑒定發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p在肌肉組織中的表達量顯著高于其他組織,通過CCK-8、Ed U及q RT-PCR等方法檢測miR-378a-3p對肌細胞增殖的作用,結(jié)果顯示超表達miR-378a-3p可顯著降低肌細胞增殖系數(shù)及增殖標志基因cyclin D1表達量,表明肌細胞增殖受到抑制;同時,超表達miR-378a-3p能夠下調(diào)細胞凋亡抑制因子BCL-2基因表達水平,上調(diào)凋亡誘導因子BAX和caspase-3基因表達水平,從而促進肌細胞凋亡。另外,超表達miR-378a-3p顯著上調(diào)肌分化因子Myo D和My HC基因m RNA和蛋白質(zhì)表達水平,促進肌細胞分化、肌管產(chǎn)生。機制研究發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p通過抑制靶基因HDAC4轉(zhuǎn)錄后翻譯水平,從而抑制肌細胞增殖,促進肌細胞的分化和凋亡。2.miR-107通過調(diào)控靶基因Wnt3a抑制牛肌細胞的增殖、分化miR-107由牛26號染色體泛酸激酶1基因(PANK1)第7內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來,與人和小鼠序列高度保守,在肌肉組織中有較高的表達水平。超表達miR-107顯著下調(diào)肌分化因子My HC、Myo D和Myo G基因m RNA及蛋白質(zhì)表達水平,抑制肌細胞分化;降低細胞增殖系數(shù)和增殖標志基因PCNA表達。同時,超表達miR-107調(diào)控肌細胞凋亡因子BCL-2、p53和caspase9基因m RNA表達和蛋白質(zhì)翻譯水平。由Target Scan軟件預(yù)測并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)證明Wnt3a基因是miR-107的一個直接靶基因。超表達miR-107顯著降低Wnt3a基因m RNA和蛋白表達水平,而si RNA干擾Wnt3a基因,可顯著抑制肌細胞分化、增殖及凋亡;這些結(jié)果表明miR-107可通抑制控靶基因Wnt3a的表達水平而調(diào)控肌細胞的分化、增殖和凋亡,可作為牛分子育種的另一分子標記。3.秦川牛肌肉組織circRNAsO7的鑒定及篩選為研究秦川牛肌肉組織中是否存在與肌肉發(fā)育相關(guān)circ RNA,本研究利用去除核糖體RNA高通量測序技術(shù),鑒定秦川牛肌肉組織胚胎和成年牛肌肉中circRNAsO7表達情況,得到了12,981個候選circRNAsO7,其中2400個circRNAsO7在胚胎和成年期肌肉組織中同時存在。特征分析顯示大多數(shù)circ RNA轉(zhuǎn)錄長度不足2000核苷酸(nt),平均長度為822nt,含2~7個外顯子,遠小于其相對的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本長度。circRNAsO7在所有染色上廣泛分布,染色體越長,產(chǎn)生circ RNA數(shù)目越多。不同時期表達差異分析,得到了828個差異表達的circRNAsO7,其中624個上調(diào),204個下調(diào),表明表達差異的circ RNA可能在牛肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。通過q RT-PCR分析了17個表達差異的circRNAsO7,結(jié)果與circ RNA測序結(jié)果一致,表明測序結(jié)果的準確性,同時發(fā)現(xiàn)circ RNA42在肌肉發(fā)育過程中下調(diào)程度最大,暗示其在肌肉發(fā)育中可能具有重要功能。4.circLMO7通過吸附miR-378a-3p調(diào)控牛肌肉原代細胞增殖、分化及凋亡circLMO7(circ RNA42)來源于LMO7基因,全長2,312 nt,包含9個外顯子,在肌肉組織中表達量顯著高于其他組織。經(jīng)RNAhybrid軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circLMO7序列中有一個miR-378a-3p結(jié)合位點,雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測表明circLMO7與miR-378a-3p靶向結(jié)合,且超表達circLMO7(pcDNA-circLMO7)能顯著降低miR-378a-3p表達量。利用CCK-8、Ed U法及q RT-PCR等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),circLMO7促進肌細胞增殖,上調(diào)增殖標志基因cyclin D1表達;同時circLMO7抑制肌細胞的凋亡,促進凋亡相關(guān)標志基因BCL-2在m RNA和蛋白水平的表達,抑制BAX和caspase9基因m RNA表達及蛋白翻譯水平。另外,circLMO7顯著下調(diào)肌肉分化標志基因MHC、Myo G和Myo D的表達水平,抑制肌細胞分化和肌管的產(chǎn)生。這些結(jié)果與超表達miR-378a-3p對細胞增殖、分化等的作用相反,同時circLMO7能增強miR-378a-3p靶基因HDAC4表達水平。綜合以上結(jié)果表明circLMO7能夠通過結(jié)合miR-378a-3p解除miR-378a-3p對靶基因HDAC4基因表達的抑制作用,進而調(diào)控肌細胞的增殖、分化及凋亡。本章研究揭示了circLMO7可能作為miR-378a-3p的上游調(diào)控因子,影響牛肌肉發(fā)育。本研究為揭示秦川牛肌肉發(fā)育分子調(diào)控機理積累了基礎(chǔ)資料并提供了新的研究思路,同時為非編碼RNA的機制研究增添了新的證據(jù),也為我國良種肉牛的資源保護和分子育種提供了新的分子標記。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

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