本文關(guān)鍵詞：人工合成甘藍型油菜的遺傳和表觀遺傳變異分析

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【摘要】：異源多倍體在進化過程中經(jīng)歷了雜交與加倍,新基因組形成后會出現(xiàn)遺傳和表觀遺傳的變異現(xiàn)象,例如基因重排、基因組結(jié)構(gòu)變異、轉(zhuǎn)座子激活、基因表達水平和表達模式的變化及DNA甲基化變異等。因此,探究異源多倍體在形成早期發(fā)生變異的可能機制,對豐富多倍體進化理論有重要的意義。異源四倍體甘藍型油菜(Brassica napus L.)由二倍體祖先種白菜(Brassica rapa L.)和甘藍(B.oleracea L.)通過種間雜交后染色體加倍得到,因其具有清晰系譜信息而成為研究植物異源多倍體化的重要對象之一。本實驗以課題組前期人工合成的甘藍型油菜及其二倍體親本(白菜與甘藍)為材料,分析了人工合成甘藍型油菜形成早期在形態(tài)學(xué)和細胞學(xué)等方面與親本之間的差異;同時,利用RNA-seq數(shù)據(jù)對異源多倍化的甘藍型油菜基因組中基因與轉(zhuǎn)座子的表達變異特征進行分析,從分子水平上探究甘藍型油菜基因組形成早期的基因組變異;另外,還利用分子標(biāo)記技術(shù)探究了人工合成甘藍型油菜多倍化過程中DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性變異情況及可能的形成機制。主要結(jié)果如下:1、人工合成甘藍型油菜與二倍體親本表型比較分析比較人工合成甘藍型油菜及其二倍體親本白菜和甘藍的形態(tài)學(xué)(如株型、葉片和花器官)和種子細胞學(xué),發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍型油菜在表型上發(fā)生一系列變化,主要包括:①植株株型較大且為松散型,有效分枝數(shù)較多,分枝部位較低,一次有效分枝的結(jié)角數(shù)較多,每角粒數(shù)變多等。②葉表皮不光滑、葉脈有少量表皮毛,葉緣呈鋸齒狀且有表皮毛,有葉耳。③花瓣形態(tài)與甘藍相似,花瓣顏色接近白菜,但花粉活力明顯比親本的強(分別為97.1%、92.1%和75.09%)。④在單位面積內(nèi)葉表面氣孔數(shù)目增多、密度較大,但氣孔的長度和寬度比白菜小。⑤利用光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡觀察和比較成熟種子內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示:白菜、甘藍的種皮紋飾和網(wǎng)脊形態(tài)差異明顯,雜種后代種皮紋飾接近白菜、呈網(wǎng)紋狀,脊條粗短有微穴并與甘藍相似。白菜的柵欄層細胞呈深褐色,甘藍的柵欄層細胞呈淡黃色,而雜種后代的柵欄層顏色介于兩個親本之間。雜種后代的糊粉層細胞最厚,甘藍的最薄。三者胚根中央分生細胞的蛋白體面積顯著低于胚根周圍薄壁細胞,而油體相對面積則相反;其中雜種后代中央分生細胞中的蛋白體面積最高,周圍薄壁細胞中蛋白體面積居于二者之間。雜種后代子葉中蛋白體積累最少,油體的體積最大且以長形為主,而兩親本子葉中蛋白體積累相對較多,油體較小呈圓形或橢圓形。2、人工合成甘藍型油菜和二倍體親本的轉(zhuǎn)錄組比較研究利用RNA-seq技術(shù)對人工合成的甘藍型油菜及其親本的葉片轉(zhuǎn)錄組進行比較分析,結(jié)果包括:①在白菜型油菜、甘藍及人工合成甘藍型油菜中檢測到表達的基因分別為21,491、21,947和40,544。甘藍型油菜與白菜相比有183個基因上調(diào)、2,192個基因下調(diào);與甘藍比較有548個基因上調(diào)、1,894個基因下調(diào)。這些后代與親本之間的差異表達基因主要與物質(zhì)合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、響應(yīng)脅迫等生物學(xué)過程有關(guān)。②對雜種后代中17,823對部分同源基因的表達特征進行分析,發(fā)現(xiàn)多數(shù)部分同源基因(占63.77%)的表達模式與兩個親本的表達模式一致,可認為多倍化過程中部分同源基因?qū)Φ谋磉_模式比較保守;通過部分同源基因?qū)Φ谋磉_偏好性分析發(fā)現(xiàn)12,221個基因的表達水平?jīng)]有差異,即它們不存在表達偏好性,另有2,322個部分同源基因?qū)ζ駻基因組表達,3,280個部分同源基因?qū)ζ駽基因組表達。③對差異表達的部分同源基因?qū)M行分析發(fā)現(xiàn),713個基因以加性表達形式出現(xiàn);分別有 2,628 個和 3,162 個基因以 C-ELD(C-Expression Level dominance)和 A-ELD(A-Expression Level dominance)形式出現(xiàn);而超親下調(diào)或上調(diào)表達的基因有54個和1,056個。基因功能注釋分析顯示C-ELD和A-ELD類型的基因與水楊酸合成、防御生物脅迫、MAPK途徑、RNA甲基化、核苷酸生物合成、rRNA加工及蛋白質(zhì)運輸?shù)认嚓P(guān);超親上調(diào)表達的基因涉及色素、類黃酮及有機物等物質(zhì)的生物合成過程。3、人工合成甘藍型油菜和二倍體親本轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子的分析深入挖掘RNA-Seq數(shù)據(jù),利用比較基因組學(xué)的手段從全基因組層面分析了人工合成甘藍型油菜與二倍體親本(甘藍和白菜)之間轉(zhuǎn)座子含量、種類和數(shù)量分布、表達模式及表達水平等方面的差異,結(jié)果表明:①兩個親本轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子所占比例分別為32.56%和14.76%,人工合成甘藍型油菜轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)座子占的比例為18.09%。在三個物種轉(zhuǎn)錄組中鑒定到了 12 種類型的轉(zhuǎn)座子(hAT、C4CTA、PIF-Harbinger、Mutator、Pong、Tcl/Mariner、Helitron、LTR/Copia、LTR/Gypsy、LTR/Unclassified、SINE 和 LINE),其中占比例最多的是 CACTA(2.02%～5.44%)、Pong(2.66～6.71%)、LTR/Copia(4.32%～10.90%)和LTR/Gypsy(2.20%～4.75%),其他類型轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)錄組中所占比例較小(約為0.09%～0.94%)。②根據(jù)RPKM值判斷轉(zhuǎn)座子表達水平的差異,分析發(fā)現(xiàn)人工合成甘藍型油菜與白菜相比有154個表達上調(diào)和162個表達下調(diào)的轉(zhuǎn)座子;與甘藍相比有147個表達上調(diào)和190個表達下調(diào)的轉(zhuǎn)座子;數(shù)目最多的差異表達轉(zhuǎn)座子是C4CT4、Pong、LTR/Copia、LTR/Gypsy和LTR/Unclassifed。③人工合成甘藍型油菜中轉(zhuǎn)座子的表達模式主要以新出現(xiàn)、沉默及只在一個親本和雜種后代中表達的模式出現(xiàn)。④對轉(zhuǎn)座子插入基因內(nèi)部的偏好性分析發(fā)現(xiàn),基因內(nèi)含子區(qū)域比外顯子區(qū)更容易插入轉(zhuǎn)座子;對有轉(zhuǎn)座子插入的基因注釋分析,顯示這部分基因涉及細胞組分、生物進程和分子功能三個方面。細胞組分方面主要與細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體、質(zhì)膜及色素等有關(guān);生物進程方面主要與蛋白質(zhì)代謝、抵抗脅迫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞組成和生物轉(zhuǎn)化、其他代謝途徑和細胞化進程等有關(guān);分子功能方面與核苷酸結(jié)合、DNA(或RNA)結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶和其他酶活性有關(guān)。這些結(jié)果暗示著轉(zhuǎn)座子對基因組結(jié)構(gòu)的形成和基因功能的發(fā)揮有重要作用。4、人工合成甘藍型油菜基因組中的反轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)錄酶序列分析采用反轉(zhuǎn)座子插入位點間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記方法(Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism,IRAP)對人工合成甘藍型油菜全基因組中的反轉(zhuǎn)座子的變化規(guī)律和可能作用機制進行分析;同時也對反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶序列構(gòu)成和進化關(guān)系進行分析。結(jié)果表明:①377對反轉(zhuǎn)座子引物進行隨機組合,共擴增出1,729個條帶,親本條帶占71.13%,雜種中消失與新增的條帶分別占5.73%和7.63%,未知條帶占15.50%,多倍化過程中反轉(zhuǎn)座子的激活頻率為0.134。②成功克隆了 70條包含有反轉(zhuǎn)座子的序列,并進行功能預(yù)測分析,結(jié)果顯示有反轉(zhuǎn)座子插入的基因主要與分子功能、生物進程及細胞組分三方面,其中比例最多的是催化或結(jié)合、特殊大分子復(fù)合物、內(nèi)膜系統(tǒng)、其他代謝過程等。這說明基因和反轉(zhuǎn)座子之間有緊密關(guān)系,可能對多倍體適應(yīng)新環(huán)境有重要意義。③利用兼并引物對反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶進行擴增,成功分離和克隆了 32條反轉(zhuǎn)錄酶序列,核苷酸序列長度變化范圍為275～284bp,氨基酸序列中包含三個保守區(qū):TAFLHG、LYGLKQ和YVDDM,這說明反轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄酶序列具有同源性和高度異質(zhì)性的特點。將克隆的序列與其他物種反轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)它們具有同源性,這意味著不同物種中的反轉(zhuǎn)座子在物種形成前可能擁有共同的祖先。5、人工合成甘藍型油菜早期世代DNA甲基化的變化分析DNA甲基化作為常見的表觀遺傳修飾,在多倍化過程中起著重要的作用。本研究以人工合成甘藍型油菜早期世代(F1,S1-S3)及其親本白菜型油菜和甘藍為實驗材料,通過DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)技術(shù)和高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技術(shù)對甘藍型油菜多倍化過程中DNA甲基化水平的動態(tài)變化進行分析。結(jié)果表明:①在F1中有53.4%的片段是來源于A和C基因組。除此之外,在雜種后代中分別有5.04%和8.87%的片段是屬于新增帶和消失帶。②與二倍體親本相比,人工合成甘藍型油菜F1代中有13.1%的基因位點發(fā)生了甲基化的改變,其中有7.86%的位點屬于高甲基化,5.24%的位點屬于DNA甲基化。利用MSAP技術(shù)比較人工合成甘藍型油菜F1及S1-S3代中的DNA甲基化水平差異,發(fā)現(xiàn)F1的甲基化水平最低(38.7%),S3世代中的甲基化水平最高(41.32%)。對DNA甲基化變異片段進行序列分析,發(fā)現(xiàn)其廣泛參與了多種生物學(xué)途徑,包括一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、蛋白修飾及轉(zhuǎn)運蛋白等。對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn),在不同的材料之中甲基化酶基因的表達水平與DNA甲基化狀態(tài)是一致的。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S565.4

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本文編號：1262603