本文關(guān)鍵詞：水稻黃綠葉突變體ys83和脆性突變體b364的基因克隆

  更多相關(guān)文章： 水稻 黃綠葉突變體 葉綠體發(fā)育 脆性突變體 細胞壁合成

【摘要】：利用正向或反向遺傳學(xué)的方法,對水稻(Oryza sativa L.)多種多樣突變體的遺傳分析和分子機理研究,揭示了高等植物中許多重要的功能基因和生物學(xué)進程,具有十分重要的理論和應(yīng)用價值。水稻葉色突變體和脆性突變體便是其中常見的研究對象,葉色突變體和突變基因的發(fā)掘為植物光合色素的合成或降解、葉綠體的發(fā)育以及質(zhì)核信號通路等細胞進程的研究奠定了大量的理論基礎(chǔ)：同樣,脆性突變體和相關(guān)基因的探索也為植物細胞壁的合成、纖維素的合成與降解甚至生物能源的開發(fā)拓展了思路。我們實驗室通過化學(xué)誘變等途徑獲得一個黃綠葉突變體ys83和一個脆性突變體b364,本研究從表型鑒定、基因克隆、功能分析等方面,對這兩個突變體進行了較為系統(tǒng)、深入的研究和探討,主要結(jié)果如下：1.水稻黃綠葉突變體yS83的基因克隆和功能分析黃綠葉突變體ys83在苗期表現(xiàn)為黃綠葉,隨著植株生長顏色逐漸加深,但直到成熟期仍然呈現(xiàn)與野生型可分辨的淺綠色。通過比較成熟期的主要農(nóng)藝性狀,發(fā)現(xiàn)ys83突變體的單株有效穗數(shù)和每穗著粒數(shù)較野生型日本晴分別下降6.7%和7.6%,其余農(nóng)藝性狀包括抽穗期、株高、結(jié)實率和千粒重等沒有明顯變化。光合色素測定結(jié)果顯示,突變體苗期和抽穗期的葉綠素和類胡蘿卜素含量都嚴重減少,尤其是苗期的色素含量幾乎只占野生型的50%左右,說明yS83的黃綠葉表型是由葉綠素的減少引起的。觀察ys83突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),與野生型相比,突變體內(nèi)葉綠體的發(fā)育受到了嚴重阻礙,葉綠體狹小細長,基粒垛疊松散且數(shù)目少。運用圖位克隆的方法,ys83突變基因被定位在水稻第2條染色體短臂上約158kb的范圍內(nèi),經(jīng)檢索水稻基因組注釋工程數(shù)據(jù)庫,在該定位區(qū)間內(nèi)共有23個注釋基因。經(jīng)PCR擴增并測序驗證比對,確定LOC_Os02g05890基因即為ys83突變體的候選基因,在ys83突變體中,該基因編碼區(qū)的第198位堿基T突變?yōu)锳,使其第66個密碼子由TGT變?yōu)門GA,翻譯提前終止,該基因被命名為YS83。進一步用轉(zhuǎn)基因互補實驗來驗證這一結(jié)果,來自野生型的YS83基因被連接到表達載體pCAMBLA2300上,將質(zhì)粒pC2300-YS83通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到y(tǒng)s83突變體中。經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因陽性植株,都恢復(fù)了野生型的表型,色素含量與野生型一致,證明YS83基因確實是控制ys83突變性狀的目的基因。YS83基因(LOC_Os02g05890)的編碼區(qū)序列全長為498bp,在水稻基因組中以單拷貝形式存在,推測可能編碼一個分子量17kDa的含165個氨基酸的EMB1303蛋白。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件預(yù)測,在YS83蛋白的N-端可能含有一個51氨基酸組成的葉綠體定位信號肽,靠近C-端含有一個甘氨酸富集結(jié)構(gòu)域。進一步用亞細胞定位實驗驗證了YS83蛋白確實定位在葉綠體上。YS83蛋白序列與其同源蛋白序列比對及進化樹結(jié)果顯示,YS83蛋白與來自單子葉植物的同源蛋白比雙子葉植物的同源蛋白具有更高的相似性和更近的親緣關(guān)系。YS83基因在水稻植株各組織中均有表達,然而在生長發(fā)育旺盛的組織中轉(zhuǎn)錄水平更高。與野生型相比,與葉綠體發(fā)育和葉綠素生物合成相關(guān)的多個基因在ys83突變體內(nèi)的表達均受到了不同程度的影響,說明YS83基因很可能是通過調(diào)節(jié)水稻葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)基因的表達進而在葉綠體的發(fā)育中發(fā)揮重要作用的。2.水稻脆性突變體b364的遺傳分析與基因克隆脆性突變體b364植株的葉片、葉鞘、莖桿、穗子等部位都表現(xiàn)出脆的特性,除此以外,其它外觀表型和產(chǎn)量性狀與野生型并無明顯差異。在環(huán)境掃描電鏡下觀察突變體和野生型的葉片與莖稈橫切面時發(fā)現(xiàn),野生型的厚壁組織結(jié)構(gòu)致密,而突變細胞排列松散,呈現(xiàn)中空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。接下來,在透射電鏡下觀察細胞壁結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),突變體的葉脈細胞的細胞壁厚度與野生型有明顯差異,并且次生壁的厚度變化最大。這說明b364突變體的細胞壁合成受到了影響,尤其是提供主要機械支撐力的厚壁組織結(jié)構(gòu)改變,細胞次生壁變薄,因此導(dǎo)致了其機械強度降低的表型。將b364與野生型親本日本晴和秈稻品種明恢63、岡46B雜交后,得到的F1植株也表現(xiàn)出脆性的表型,這說明該脆性性狀呈顯性遺傳,F2代群體分離符合3：1比例,表明該脆性表型受一對顯性核基因控制。接下來利用圖位克隆技術(shù),將b364突變基因定位在了水稻第1條染色體長臂約145kb的范圍內(nèi)。這一區(qū)間共有注釋基因23個,其中8個是轉(zhuǎn)座子,余下的15個基因中,根據(jù)其預(yù)測的蛋白功能,優(yōu)先選擇其中4個作為候選基因進行PCR擴增和測序驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)b364突變體中一個基因發(fā)生了一對堿基突變,導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變,此基因即被認為是b364脆性性狀的候選基因并被命名為B364。因正在進行后續(xù)實驗,基因具體編號需要暫時保密,請理解。隨后將該顯性突變基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入野生型親本日本晴中,得到的陽性轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出脆性性狀,從而驗證了該候選基因。這些結(jié)果說明,脆性突變體b364的脆性表型確實是由于B364基因的突變引起的。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S511

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 童川;童杰鵬;孫出;沈圣泉;;水稻脆性基因的功能研究進展[J];分子植物育種;2013年02期

2 蔡敏;;離子束誘變技術(shù)破解水稻秸稈還田難題[J];湖南農(nóng)業(yè);2012年06期

3 ;A Mutation of OSOTP 51 Leads to Impairment of Photosystem I Complex Assembly and Serious Photo-damage in Rice[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年02期

4 鄭丹;遲鳳琴;;秸稈還田在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的綜合評價[J];黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年01期

5 ;Rice Brittleness Mutants: A Way to Open the ‘Black Box’ of Monocot Cell Wall Biosynthesis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年02期

6 彭應(yīng)財;甘朝洪;王鶴潼;徐正進;;顯性脆稈水稻不育系中脆A的選育[J];雜交水稻;2010年04期

7 李秀蘭;孫小秋;王平榮;周慧;鄧曉建;;一個新的水稻黃綠葉突變體的遺傳分析與基因定位[J];作物學(xué)報;2010年06期

8 ;Genetic analysis and molecular mapping of a novel gene for zebra mutation in rice (Oryza sativa L.)[J];遺傳學(xué)報;2009年11期

9 宋東亮;沈君輝;李來庚;;高等植物細胞壁中纖維素的合成[J];植物生理學(xué)通訊;2008年04期

10 嚴長杰;嚴松;曾秀紅;張正球;顧銘洪;;OsCesA4的等位基因Bc7(t)的精細定位和分離(英文)[J];遺傳學(xué)報;2007年11期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫小秋;水稻5份黃綠葉突變體和1份雄性不育突變體的遺傳分析與基因定位[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號：1261276