本文關鍵詞：MG132對豬卵母細胞體外成熟及德保黑豬核移植胚胎發(fā)育的影響初步研究

  更多相關文章： 泛素蛋白酶體通路 MG132 德保黑豬 體細胞核移植 表觀遺傳修飾 合子基因激活

【摘要】：體細胞核移植技術效率不高是制約該技術應用的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn),與體內(nèi)發(fā)育或體外受精胚胎相比,克隆胚胎在表觀遺傳修飾、母源-合子轉(zhuǎn)換、多能性維持方面均存在較大差異。泛素蛋白酶體通路是真核細胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)降解途徑,其參與了細胞周期進程,基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾、生殖細胞發(fā)生以及早期胚胎發(fā)育等生命活動。有研究發(fā)現(xiàn),在卵母細胞體外成熟或重構胚融合/激活階段,添加蛋白酶體抑制劑MG132能夠提高哺乳動物核移植胚胎的發(fā)育能力,并提高克隆動物的妊娠率,說明泛素蛋白酶體通路對克隆胚胎發(fā)育起著重要的作用。為了進一步了解泛素蛋白酶體通路對豬卵母細胞體外成熟以及廣西德保黑豬體細胞核移植胚胎發(fā)育的調(diào)控機理,本研究首先研究了 MG132處理對豬卵母細胞核質(zhì)成熟的影響,并通過觀察其對德保黑豬體細胞核移植胚胎發(fā)育潛能的影響,確定其較優(yōu)化處理方法。通過分析母源-合子轉(zhuǎn)換、多能性基因表達以及表觀遺傳修飾變化等,以進一步了解泛素蛋白酶體通路在核移植胚胎發(fā)育中的作用機理,為提高德保黑豬體細胞核移植效率奠定基礎。1.MG132處理對卵母細胞成熟以及德保黑豬核移植胚胎發(fā)育能力的影響首先,為了解MG132處理對卵母細胞核、質(zhì)成熟的影響,在豬卵母細胞體外成熟30-42 h時間段添加不同濃度MG132。醋酸地衣紅染色結果顯示,不同濃度MG132處理的豬卵母細胞,其到達MⅡ期的比率沒有顯著差異(P0.05)。對成熟后卵母細胞活性氧檢測發(fā)現(xiàn),隨著MG132濃度的升高,成熟卵母細胞的ROS水平呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。與未處理組相比,1、2.5、5μmol/L組ROS水平顯著降低(P0.05),10μmol/L組與其他各組間差異均不顯著(P0.05)。皮質(zhì)顆粒染色結果顯示,1μmol/LMG132處理能夠提升成熟卵母細胞皮質(zhì)顆粒完全遷移至皮質(zhì)區(qū)(類型Ⅰ)的比率,與未處理組之間沒有顯著差異(P0.05);同時,隨著MG132濃度的升高,其他3個處理組類型Ⅰ卵母細胞的比率顯著降低(P0.05)。其次,對MG132處理卵母細胞及核移植胚胎條件進行了優(yōu)化。首先在豬卵母細胞成熟過程中添加不同濃度MG132,以成熟后的卵母細胞進行核移植。結果發(fā)現(xiàn),1 μmol/L組的胚胎分裂率顯著高于未處理組和2.5、5μmol/L組(69.61%vs 58.91%,60.32%,60.87%,P0.05);與未處理組相比,1 μmol/L組的囊胚率無顯著變化(14.71%vs 11.02%,P0.05),但顯著高于2.5、5、10 μmol/L 組(14.71%vs 9.52%,8.70%,6.57%,P0.05)。其次,以未處理的卵母細胞進行核移植操作,采用不同濃度MG132處理融合/激活后重構胚。結果顯示,5μmol/L組的囊胚率顯著高于未處理組和1、10μmol/L組(26.16%vs 15.50%,18.01%,16.67%,P0.05),但與 2.5μmol/L 組(21.39%)差異不顯著(P0.05)。最后,采用1μmol/L MG132處理未成熟豬卵母細胞,經(jīng)過MG132處理的卵母細胞成熟后用于生產(chǎn)核移植重構胚,隨后用不同濃度MG132處理融合/激活后重構胚,設未經(jīng)MG132處理的核移植重構胚為對照組。結果顯示,5 μmol/L組的囊胚率顯著高于對照組和 1、2.5、10μmol/L 組(36.51%vs14.40%,23.33%,21.54%,7.02%,P0.05),5μmol/L組的囊胚細胞總數(shù)顯著高于對照組和1、10μmol/L組(52.5±4.01 vs 37.33±0.51,41.11±1.72,31±1.15,P0.05)。后續(xù)試驗采用1μmol/L+5μmol/LMG132聯(lián)合處理方法進行。2.泛素-蛋白酶體通路對豬核移植胚胎重要母源因子表達的影響為了解MG132處理對重要母源因子表達的影響,揭示泛素蛋白酶體途徑調(diào)控克隆胚胎發(fā)育潛能的機制,我們首先對Tet3、NLRP5和5-mC蛋白表達進行了免疫組化分析。結果顯示,與未處理組相比,Tet3和NLRP5蛋白表達水平在MG132處理的MⅡ期卵母細胞和原核階段的核移植胚胎中均顯著升高(P0.05);5-mC在未處理組和MG132處理組原核期胚胎中無明顯熒光信號,2-細胞期胚胎中重新出現(xiàn)且隨后呈現(xiàn)升高的趨勢。為了驗證MG132是否對DNA去甲基化的影響發(fā)生在更早的原核階段,我們對6 h和12 h時間段的核移植原核胚胎進行分析。結果發(fā)現(xiàn),與未處理組相比,在這2個時間段中,Tet3與5-mC的熒光信號比率在MG132處理的核移植胚胎中均極顯著升高(P0.01),NLRP5蛋白表達水平顯著提高(P0.05)。采用qRT-PCR方法分析了卵母細胞和核移植胚胎中重要母源效應基因表達水平。結果發(fā)現(xiàn),NPM2、Zar1、NLRP5和Tet3基因在未處理組和MG132組卵母細胞及早期分裂核移植胚胎中均有較高的表達,從核移植2-細胞期胚胎至囊胚期明顯下降,在囊胚期降至最低。NPM2,Zar1,NLRP5和Tet3基因表達水平在MG132處理的MⅡ期卵母細胞和核移植原核胚中都顯著升高(P0.05),這些基因的表達規(guī)律與免疫熒光的結果相一致。3.MG132處理對豬卵母細胞和核移植胚胎組蛋白修飾和ZGA相關基因表達的影響首先采用免疫組化方法分析了 MG132處理對成熟階段豬卵母細胞H3K4me3和H3K9me3蛋白表達的影響。結果顯示,未處理組豬卵母細胞體外成熟過程中,H3K4me3水平從GV期至MⅡ期不斷降低,在GVBD期達到最低;H3K9me3水平從GV期至GVBD期呈現(xiàn)上升趨勢,在GVBD期達到最高,Pre-MⅠ期至MⅡ期未檢測到H3K9me3熒光信號。1μmol/L MG132處理組AT-Ⅰ和MⅡ期卵母細胞中H3K4me3表達水平均顯著高于未處理組,未檢測到H3K9me3熒光信號。為了解泛素-蛋白酶體通路和組蛋白去乙酰化調(diào)控對豬核移植胚胎發(fā)育的不同影響,分別使用MG132和TSA兩種藥物處理胚胎。結果顯示,MG132和TSA處理的核移植胚胎4-細胞率(64.94%,60.66%vs 49.61%,P0.05)、囊胚率(29.91%,23.77%vs 13.95%,P0.05)以及囊胚細胞總數(shù)均顯著高于未處理組,兩處理組之間沒有顯著差異(P0.05)。與未處理組相比,MG132和TSA處理均能提高2-、4-細胞期豬核移植胚胎RNApolⅡ蛋白水平;與未處理組和TSA處理組相比,MG132處理顯著提高了 2-、4-細胞期豬核移植胚胎中eIF3A和TFⅡA基因的表達水平(P0.05);與未處理組相比,添加TSA同樣能夠顯著提高2-、4-細胞期豬核移植胚胎中eIF3A和TFⅡA基因的表達水平(P0.05),但其4-細胞核移植胚胎的eIF3A和TFⅡA基因表達水平顯著低于MG132處理組(P0.05)。利用細胞免疫組化和qRT-PCR技術進一步分析了組蛋白修飾及相關修飾酶基因在豬核移植胚胎中的表達狀況。結果顯示,與未處理組相比,MG132和TSA處理能顯著提高1-和4-細胞期豬核移植胚胎中H3K4me3表達水平(P0.05),并顯著降低H3K9me3表達(P0.05);同時MG132和TSA處理顯著提高了 1-細胞期克隆胚胎H3K9ac水平(P0.05),TSA處理顯著提高了桑椹胚和囊胚中H3K9ac水平(P0.05)。qRT-PCR結果顯示,HAT1、HDAC1、HDAC2、ASHL2、SMYD3、KDM5A 和 KDM5B 基因在MG132和TSA處理組1-至4-細胞期核移植胚胎中有相近的表達趨勢,HDAC1、HDAC2、KDM5A和和KDM5B基因在TSA處理的桑椹胚和囊胚中呈下降趨勢,HAT1、HDAC1、HDAC2、SMYD3、KDM5A 和 KDM5B基因在MG132處理的桑葚胚和囊胚中的表達都顯著高于TSA組和未處理組(P0.05)。4.MG132處理對德保黑豬核移植胚胎質(zhì)量的影響首先通過TUNEL法分析不同處理方法對核移植胚胎細胞凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)MG132處理組核移植囊胚的細胞凋亡數(shù)顯著低于未處理組(P0.05),TSA處理組囊胚細胞凋亡數(shù)有所降低.,但與未處理組和MG132處理組相比沒有顯著差異(P0.05)。其次,通過免疫組化技術對核移植囊胚的多能性、滋養(yǎng)層和內(nèi)細胞團分化狀況進行了檢測。結果顯示,與未處理組相比,MG132和TSA處理均能顯著提高豬核移植囊胚中Oct4蛋白的表達(P0.05),且MG132處理組的Oct4蛋白表達顯著高于TSA處理組(P0.05)。CDX2蛋白免疫組化結果顯示,與未處理組相比,MG132和TSA處理均能顯著提高囊胚細胞總數(shù)(51.2±5.8,51.0±5.6vs35.7±4.2,P0.05),但內(nèi)細胞團細胞數(shù)(ICM)沒有顯著差異(11.43±4.3 vs 9.71±2.8,P0.05)。從ICM占細胞總數(shù)的比率結果來看,TSA處理顯著高于MG132和未處理組(29.03%vs 23.27%,18.01%,P0.05)。為進一步了解MG132處理對豬核移植胚胎發(fā)育質(zhì)量影響的分子機理,采用qRT-PCR方法分析了凋亡相關基因、多能性相關基因等在核移植胚胎中的表達水平。結果顯示,與對照組相比,MG132處理顯著抑制了核移植囊胚中Bax基因的表達,并且顯著提高了 Bcl-2,Nanog,Oct4和CDX2基因的表達水平(P0.05);TSA處理顯著降低了核移植囊胚中Bax基因的表達,顯著提高了 Nanog,Oct4基因的表達水平(P0.05),但是顯著降低了CDX2基因的表達水平(P0.05)。最后,探討了 MG132處理對核移植胚胎全程發(fā)育能力的影響。結果發(fā)現(xiàn),在移植的4個批次中,只有一個移植MG132處理胚胎的批次獲得了流產(chǎn)胎兒。采用DNA微衛(wèi)星方法分析了流產(chǎn)胎兒、供體細胞、受體母豬以及對照組組織DNA的親緣關系,結果顯示,流產(chǎn)胎兒基因組來源于供體細胞,初步證實獲得了 MG132處理的體細胞克隆豬。以上結果表明,(1)MG132處理對豬卵母細胞核成熟沒有影響,可降低成熟卵母細胞活性氧水平,并促進皮質(zhì)顆粒完全遷移至皮質(zhì)區(qū);(2)MG132處理能夠在一定程度上調(diào)控豬卵母細胞和核移植胚胎中母源蛋基因的表達水平,提高核移植原核胚DNA去甲基化能力;(3)MG132處理能夠促進德保黑豬豬核移植胚胎合子基因啟動,同時在一定程度上調(diào)控德保黑豬核移植胚胎中組蛋白表觀遺傳修飾基因的表達;(4)MG132處理能夠降低德保黑豬核移植胚胎囊胚細胞凋亡,并且促進TE和ICM的分化以及多能性因子的表達;(5)優(yōu)化的MG132處理條件能夠生產(chǎn)德保克隆黑豬。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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