本文關鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型糖基化位點突變對病毒復制能力和致病性的影響及抗體膠體金檢測方法的建立

  更多相關文章： 豬圓環(huán)病毒2型 遺傳演化 感染性克隆 糖基化位點 突變體 致病性 膠體金試紙條

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道病復合征(PRDC)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、豬增生性和壞死性肺炎(PNP)、豬的流產和死亡綜合征(SAMS)和豬先天性腦震顫(CT)等嚴重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的疫病的主要原因,感染后能引起感染母豬繁殖障礙以及免疫抑制,造成極大的經濟損失。世界各地分離的PCV2毒株被分成不同的亞型而且毒株也在不斷發(fā)生變異。從2005年到2013年課題組共從山東省分離到32株PCV2毒株。對這32株病毒全基因組進行了測序并遞交GenBank。同源性分析發(fā)現(xiàn)32株PCV2 ORF1基因編碼蛋白質同源性為98.4-100%,而且三個糖基化位點23-25aa(NPS)、256-258aa(NQT)及286-288aa(NAT)沒有發(fā)生變異。ORF2基因編碼蛋白質同源性為88-100%,其糖基化位點143-145aa(NYS)同樣沒有發(fā)生變異。遺傳演化分析顯示PCV2b/1C亞型是目前山東省主要流行亞型,可能是由于選擇的壓力,此亞型已與目前使用的PCV2疫苗亞型明顯不同。感染性克隆是研究病毒基因組結構與功能以及病毒宿主相互作用的重要手段,是純化病毒以進行致病性研究和疫苗生產最好的方法。為了獲得PCV2的感染性克隆,本研究通過對構建PCV2的感染性克隆方法進行比較獲得了較好的拯救病毒的方法。本研究共構建四種PCV2感染性克隆并轉染PK-15細胞。應用IFA和Real-time PCR方法檢測拯救病毒。結果顯示四種方法構建的感染性克隆都能夠用IFA檢測到拯救病毒。但是Real-time PCR結果顯示環(huán)化DNA轉染的方法能夠檢測到最多的PCV2 DNA拷貝,pEASY-PCV2方法拷貝數(shù)最少,pSK-2PCV2和pSK-PCV2兩種方法檢測到相似的DNA拷貝數(shù)。本研究為PCV2感染性克隆的構建和拯救打下了良好的基礎。為研究PCV2 Cap蛋白糖基化位點對病毒復制以及致病性的影響,以實驗室前期構建的含有PCV2全基因組的重組質粒pEASY-Blunt-PCV2為最初模板。利用重疊PCR和感染性克隆構建方法,設計1對引物,對PCV2 Cap蛋白上N-糖基化位點143aa-145aa(NYS)進行突變(將N突變?yōu)镈),構建含突變位點感染性克隆并成功拯救病毒。結果顯示糖基化位點突變對病毒的復制能力與未突變病毒差異不顯著(P0.05)。對拯救病毒傳代后,人工感染6周齡BALB/c雌性小鼠。結果顯示含有突變位點拯救病毒攻毒后影響攻毒小鼠的體重增長,并能在血液中檢測到PCV2特異性抗體,在攻毒小鼠各個臟器中都能檢測到病毒,病理檢測結果顯示PCV2對各個臟器都造成不同程度的損傷,并且在抗體水平、損傷程度等方面與不含突變位點感染性克隆攻毒組差異不顯著(P0.05),但與細胞液攻毒對照組相比差異極顯著(P0.01)。PCV2引起的系列疾病頻繁爆發(fā)給各地養(yǎng)豬業(yè)疫病防控帶來巨大的難題。為了實現(xiàn)對PCV2的快速診斷,課題組采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,并將其標記SPA,將金標SPA包被至玻璃纖維膜上制備金標墊,將純化的Cap蛋白、抗SPA抗體分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線與質控線上,建立了一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的膠體金免疫層析方法,并組裝試紙條。檢測結果顯示,組裝的檢測卡只與豬圓環(huán)病毒陽性血清發(fā)生特異性反應,檢測的靈敏度可以稀釋到100倍。用此檢測卡與商品化ELISA試劑盒對86份臨床血清進行對比檢測,兩者的陽性率分別為65.12%和70.93%,符合率為94.2%。該方法檢測速度快,15min內可出結果,特異性強,操作簡便,可廣泛應用于基層。
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 龔振華,尹燕博,沈廣;豬圓環(huán)病毒:一種新發(fā)現(xiàn)的病原[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年S1期

2 王麗榮;;豬圓環(huán)病毒的病原學與診斷[J];安徽農業(yè)科學;2006年06期

3 孫艷明;趙德明;;豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2006年07期

4 IGORMOROZOV,李凱年;豬圓環(huán)病毒及臨床意義[J];國外畜牧科技;1999年05期

5 馮衛(wèi);陳沫;楊曉容;聶克艷;陳靜;姜萍;楊林;劉海;顏艷;王海;;基于文獻計量法分析我國豬圓環(huán)病毒的研究現(xiàn)狀[J];農技服務;2013年12期

6 王志軍;郭慧娟;李秀麗;董樹仁;鄢明華;;豬圓環(huán)病毒病原學研究進展[J];天津農業(yè)科學;2014年08期

7 ;獸藥新產品——豬圓環(huán)病毒疫苗[J];科技致富向導;2010年28期

8 段麗麗,文心田,曹三杰,馬曉平;豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2005年06期

9 丁昌春;鄭新勇;楊世興;;豬圓環(huán)病毒研究進展[J];中國動物檢疫;2006年08期

10 王慧杰;喬宏興;;豬圓環(huán)病毒河南株的分離鑒定[J];中國農學通報;2007年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王東方;安春霞;劉光輝;閆若潛;吳志明;;豬圓環(huán)病毒1、2型多重PCR診斷方法建立及應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

2 馮麗麗;張改平;張麗萍;朱禮倩;李嬌;楊蘇珍;席俊;;豬圓環(huán)病毒致病機理的研究進展[A];河南省畜牧獸醫(yī)學會第七屆理事會第二次會議暨2008年學術研討會論文集[C];2008年

3 黃立平;劉長明;危艷武;陸月華;郭龍軍;溫士剛;武嘉男;吳洪麗;;檢測豬圓環(huán)病毒2型血清中和抗體阻斷ELISA方法的建立及應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術研討會論文集（上冊）[C];2009年

4 程榮華;劉云志;孫健;呼延含蓉;趙欣;邵洪澤;張麗媛;楊金生;;淺談豬圓環(huán)病毒研究現(xiàn)況[A];低碳經濟與科學發(fā)展——吉林省第六屆科學技術學術年會論文集[C];2010年

5 王鑫;葉賀佳;李敏;仇微紅;孫招金;梁昭平;;豬圓環(huán)病毒研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會2010年學術年會（第三屆中國獸藥大會學術論壇）論文集[C];2010年

6 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第十一次獸醫(yī)病理學、第十次動物病理生理學學術研討會論文集[C];2001年

7 郎洪武;趙德明;王力;張廣川;程君生;宋立;;豬圓環(huán)病毒分離、鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征[A];第四屆中國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集[C];2001年

8 蘆銀華;談國蕾;陳德勝;陳溥言;;豬圓環(huán)病毒、豬繁殖和呼吸綜合征病毒快速檢測方法的研究[A];豬的重要傳染病防治研究新成果——中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業(yè)委員會第7次學術交流會論文集[C];2002年

9 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）[C];2003年

10 萬遂如;;豬圓環(huán)病毒感染的防治[A];現(xiàn)代化養(yǎng)豬企業(yè)經營管理研討會論文集[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 臨城縣畜牧辦公室 張榮連;豬圓環(huán)病毒與肺炎混感的診治[N];河北科技報;2014年

2 江蘇省農科院獸醫(yī)所 俞正玉 林繼煌;豬圓環(huán)病毒感染[N];江蘇農業(yè)科技報;2004年

3 李凱年 譯;日本韓國發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒感染[N];中國畜牧水產報;2001年

4 記者 尹江勇;“豬圓環(huán)病毒疫苗”技術實現(xiàn)國產化[N];河南日報;2010年

5 張曉鵬　記者 李麗云;國內首創(chuàng)“豬圓環(huán)病毒新一代疫苗”研制成功[N];科技日報;2010年

6 記者 孟山　李松戰(zhàn);豬圓環(huán)病毒疫苗在洛研制成功[N];洛陽日報;2010年

7 記者 喬地　通訊員 聞亞麗;“豬圓環(huán)病毒”疫苗批準上市[N];科技日報;2010年

8 邢臺市獸醫(yī)院 邢蘭君 楊立帆;豬圓環(huán)病毒與附紅細胞體混感怎么辦[N];河北科技報;2014年

9 張曉鵬;“豬圓環(huán)病毒疫苗”全國推廣[N];農民日報;2010年

10 本報記者 喬地　通訊員 馬焱 鄭世孝;科技創(chuàng)新,走在富民強國的路上[N];科技日報;2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周瑩珊;豬圓環(huán)病毒2型感染誘導PK-15細胞內質網應激與凋亡的機制研究[D];浙江大學;2016年

2 時建立;豬圓環(huán)病毒2型糖基化位點突變對病毒復制能力和致病性的影響及抗體膠體金檢測方法的建立[D];山東師范大學;2016年

3 蘆銀華;華東地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學調查及其感染性核酸的構建[D];南京農業(yè)大學;2003年

4 司興奎;豬圓環(huán)病毒2型感染對豬免疫功能影響的細胞與分子機制[D];中國農業(yè)大學;2005年

5 曲連東;豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應用[D];南京農業(yè)大學;2006年

6 華利忠;豬圓環(huán)病毒2型誘導仔豬淋巴細胞凋亡途徑的研究[D];南京農業(yè)大學;2011年

7 溫立斌;豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學研究[D];中國農業(yè)大學;2005年

8 董林;豬圓環(huán)病毒2型診斷試劑盒的研制與應用[D];吉林大學;2014年

9 朱善元;江蘇部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的檢測及其免疫接種試驗[D];南京農業(yè)大學;2008年

10 潘群興;豬圓環(huán)病毒2型感染分子診斷與防制的相關研究[D];南京農業(yè)大學;2008年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳冬杰;豬圓環(huán)病毒2型與豬鼻支原體共感染協(xié)同致病性研究[D];中國農業(yè)科學院;2015年

2 李麗;豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達及抗體ELISA方法的建立[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2011年

3 侯成才;豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白基因在畢赤酵母中的表達與復合水佐劑的研制[D];南京農業(yè)大學;2014年

4 陳福旺;豬瘟病毒感染報告細胞系和豬圓環(huán)病毒2型敏感細胞系的建立[D];吉林大學;2016年

5 陳靈艷;豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白ORF2的原核表達系統(tǒng)的研究[D];福州大學;2014年

6 張廣芳;豬圓環(huán)病毒2型ORF3基因的原核表達與間接ELISA檢測方法的建立及初步應用[D];西北農林科技大學;2016年

7 胡瑞麗;基于LAMP和熒光定量PCR技術的豬圓環(huán)病毒2型和豬細小病毒檢測試劑盒的研制[D];上海師范大學;2016年

8 杜文娟;表達豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構建及其生物學特性鑒定[D];中國農業(yè)科學院;2016年

9 劉杏;豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學調查及基因進化分析[D];中國農業(yè)科學院;2016年

10 呂陽;豬圓環(huán)病毒2型Rep蛋白多聚體形成的關鍵氨基酸位點研究[D];華中農業(yè)大學;2016年

，

本文編號：1258998