發(fā)布時間：2017-11-24 12:33

  本文關(guān)鍵詞：抗犬賈第蟲α-12賈第素單克隆抗體的制備及應(yīng)用

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【摘要】：賈第蟲是一種人獸共患寄生原蟲，呈世界性分布，主要寄生于鳥類、兩棲類及哺乳動物（包括人類）等各種動物，引起被感染對象患有賈第蟲�。╣iardiosis, giardiasis），臨床主要特征為腹瀉和消化不良。 賈第蟲病已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為全世界危害人類健康的十大主要的人獸共患寄生蟲病之一。賈第蟲病不僅給世界各國畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害，而且嚴(yán)重危害了人類的健康。因此，建立快速準(zhǔn)確診斷賈第蟲病的方法和科學(xué)有效防治賈第蟲病，已成為需要迫切解決的問題。 目前應(yīng)用于賈第蟲病的診斷方法包括病原形態(tài)學(xué)檢查、免疫學(xué)檢測技術(shù)以及分子生物學(xué)檢測技術(shù)。其中，糞樣病原檢查方法有敏感性低、漏檢率高、需要專業(yè)人員等缺點(diǎn)；分子生物學(xué)檢測技術(shù)雖然能夠快速、敏感的診斷賈第蟲病，然而由于需要極專業(yè)、昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)的操作人員，也是成本最高的檢測方法之一；免疫學(xué)方法檢測賈第蟲感染的特點(diǎn)是特異性高，操作簡便，價(jià)格便宜，在賈第蟲病的診斷中起著至關(guān)重要的作用。其中酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）既能檢測抗原，也能用于檢測抗體，適用于大量樣品的檢測，雙抗夾心ELISA的特異性較普通ELISA更高。目前已有檢測人賈第蟲病的血清間接ELISA和糞便雙抗夾心ELISA試劑盒。但尚無犬相關(guān)試劑盒。 近年來國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量關(guān)于賈第素的研究�，F(xiàn)已證實(shí)，在賈第蟲的多種骨架蛋白中，包含有α、β、γ和ζ4類賈第素。其中α-賈第素可能是進(jìn)化過程中膜聯(lián)蛋白的代表，很可能具有保守的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域而行使相似的功能。尚沒有以α-12賈第素為基礎(chǔ)的診斷犬賈第蟲病的方法。因此建立以α-12賈第素為基礎(chǔ)的診斷犬賈第蟲病的方法對探討賈第蟲新藥靶點(diǎn)、臨床診斷治療方面都具有重要意義。 犬是人感染賈第蟲的重要傳染源，且與人類接觸最為密切。因此建立犬賈第蟲病的診斷方法十分必要。 本試驗(yàn)通過原核表達(dá)賈第蟲Alpha-12giardin(α-12賈第素)蛋白制備單克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，旨在為犬賈第蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查等方面提供一種快速適用、特異性強(qiáng)的免疫學(xué)檢測方法。 賈第蟲α-12賈第素基因的克隆、原核表達(dá)及蛋白純化：以賈第蟲總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增α-12賈第素基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-28a-α-12賈第素，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）中，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，37℃條件下經(jīng)1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h后，得到分子量（Mr）約為38kDa的包涵體蛋白，與預(yù)期大小一致。蛋白質(zhì)印跡（Western blot）表明，能夠應(yīng)用小鼠抗賈第蟲陽性血清，識別出α-12賈第素重組蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性。將目的蛋白利用超聲破碎，并通過Ni-親和層析柱純化，經(jīng)SDS-PAGE分析，在38kDa處可見有單一的一條蛋白帶。 基于α-12賈第素間接ELISA檢測鼠感染犬賈第蟲方法的建立：選擇α-12賈第素蛋白為檢測抗原，以賈第蟲陽性小鼠血清為一抗，建立間接ELISA檢測鼠感染犬賈第蟲方法，確定抗原的最佳包被量為0.25μg/孔，待檢血清最佳稀釋度為1:800，最佳封閉劑是5%脫脂奶粉，HRP標(biāo)記二抗的最佳工作濃度為1:5000，試驗(yàn)具有可重復(fù)性；試驗(yàn)可檢出鼠賈第蟲高免血清最大稀釋度為1:25600，具有靈敏性；對賈第蟲的檢測具有特異性，與鼠抗路氏錐蟲血清、鼠抗隱孢子蟲血清和鼠抗弓形蟲血清無交叉反應(yīng)。本試驗(yàn)方法為后期制備單克隆抗體試驗(yàn)中檢測感染后血清中的特異性抗體奠定基礎(chǔ)。 基于α-12賈第素間接ELISA檢測犬感染賈第蟲方法的建立：以α-12賈第素蛋白為抗原，以感染賈第蟲后的陽性犬血清為一抗，建立間接ELISA檢測犬感染賈第蟲方法。確定抗原最佳包被濃度為2.0μg/孔，一抗血清的稀釋度為1:100，最佳封閉劑為5%脫脂奶粉，HRP-標(biāo)記二抗的最佳稀釋度為1:5000。本試驗(yàn)方法的敏感性較高，血清稀釋到1:200時仍可檢測到陽性；試驗(yàn)方法具有較高的特異性和可重復(fù)性，對65份犬待檢血清樣品的賈第蟲檢出率為92.3%。 抗α-12賈第素單克隆抗體的制備及純化：用純化的重組抗原免疫BALB/c小鼠，抗體效價(jià)達(dá)1:105以上后進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出2株能穩(wěn)定分泌抗重組抗原的單克隆抗體3H10和4C9，單抗亞類均為IgG2b，單抗3H10效價(jià)為1:8000，而4C9具有較高的效價(jià)，可達(dá)到1:104。Western blot表明單克隆抗體3H10和4C9可識別重組蛋白。 雙抗體夾心ELISA檢測犬感染賈第蟲方法的建立與應(yīng)用：應(yīng)用的捕獲抗體為3H10株單克隆抗體，檢測抗體為HRP-標(biāo)記的4C9株單克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測犬感染賈第蟲的方法，應(yīng)用于檢測犬糞樣本中的賈第蟲抗原。確定最佳檢測條件為：抗體最適包被濃度為0.01μg/μL，待檢糞液最佳稀釋倍數(shù)為1：2，酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：400，與犬等孢球蟲、犬隱孢子蟲、犬蛔蟲樣品均無交叉反應(yīng)。批次間和批次內(nèi)變異系數(shù)較小，重復(fù)性很高。對120份泰迪犬糞樣檢測結(jié)果為賈第蟲總感染率33.33%（41/120），檢測122份警犬糞樣賈第蟲感染率為36.9%。該方法的建立為犬賈第蟲病流行病學(xué)診斷和調(diào)查方面提供了一種較簡便、快速、特異的免疫學(xué)檢測方法。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1222300