本文關(guān)鍵詞：番茄早疫病菌對啶酰菌胺的抗性檢測及抗性機理初探

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【摘要】：由Alternaria solani侵染所引起的番茄早疫病是栽培番茄上的一種葉部病害,影響著番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。啶酰菌胺于2008被引入中國用于番茄早疫病的防治。然而,在使用5年后仍然沒有A. solani對啶酰菌胺的敏感性／抗性方面的相關(guān)報道。因此,本文檢測了山西省不同地區(qū)番茄早疫病菌A. solani對啶酰菌胺的敏感性,明確了山西省各地區(qū)A. solani對啶酰菌胺抗性的現(xiàn)狀,并對抗性菌株的適合度、生物學(xué)特性、細胞膜滲透性、生理生化特性及抗藥性分子機理等方面進行了研究,主要研究結(jié)果如下：1、從山西省五個地區(qū)共采集分離到100株A. solani,通過測定菌株對啶酰菌胺的敏感性發(fā)現(xiàn)：啶酰菌胺對這些菌株EC50值范圍為0.3104～164.1976μg·mL-1,均值為12.9354±25.007μg·mL-1,這些田間菌株對啶酰菌胺的敏感性有較大差異,有54%的菌株對啶酰菌胺產(chǎn)生了抗性,其中抗性(R類)菌株中有76%中抗(RM)菌株；這些R類菌株在忻州和運城地區(qū)出現(xiàn)頻率最高,且還在忻州地區(qū)檢測到了2株極高抗(RVH)菌株。各地區(qū)A. solani對啶酰菌胺的抗性指數(shù)(RI)范圍為0.28～0.49,均值為0.38士0.08,經(jīng)卡平方獨立性檢測發(fā)現(xiàn)這五個地區(qū)的A. solani對啶酰菌胺的抗性無顯著差異(χ2=0.78χ2 0.05,20,P0.05)。2、測定了A. solani抗、感啶酰菌胺菌株的適合度,并采用常用殺菌劑對R類菌株進行防治。結(jié)果表明：各抗性水平菌株在無啶酰菌胺的平板上連續(xù)培養(yǎng)20代后,抗性不喪失,可穩(wěn)定遺傳。R類菌株的菌絲生長明顯隨著抗性的增高而有所下降(P0.05)；產(chǎn)孢量比敏感(S類)菌株的明顯增多(P0.05),但孢子萌發(fā)率無明顯變化(P0.05)；產(chǎn)毒量增多(P0.05),導(dǎo)致抗性菌株致病力的增強；由此可推斷R類菌株在自然環(huán)境中存活的概率較大,利于形成有優(yōu)勢的抗性群體。A. solani對啶酰菌胺和對其他4種常用殺菌劑(啶菌VA唑、苯醚甲環(huán)唑、多抗霉素和殺毒礬)之間不存在交互抗性。多抗霉素對各個抗性水平菌株的防治效果,包括占優(yōu)勢的RM菌株,都沒有顯著差異(P0.05),故可將多抗霉素看作是防治啶酰菌胺抗性群體的最好選擇。3、比較了A. solani抗、感菌株的菌絲形態(tài),測定了它們的最適溫度和pH值,研究了不同營養(yǎng)條件對A. solani抗、感菌株生長的影響。結(jié)果表明：R類菌株菌絲的橫隔增多,且顏色加深,RM類和RVH類菌株菌絲直徑變小。25℃時,R類菌株的生長速率明顯低于S類菌株的(P0.05),30℃時,R類與S類菌株的生長速率則無明顯差異(P0.05)。s類和RM類菌株的最適生長溫度為25℃,高抗(RH類)和RvH類菌株的最適生長溫度為25-30℃。S類、RM類、RH類和RVH類菌株的最適pH值分別為6～8、5～9、5～8、5～8(P0.05),最佳碳源分別為淀粉和乳糖、淀粉和乳糖、乳糖、淀粉,最佳氮源分別為蛋白胨、蛋白胨、大豆粉、玉米粉和蛋白胨。說明A. solani對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性后,菌絲形態(tài)發(fā)生了一定的變化,最適生長溫度有所提高,最適pH值的范圍有所改變,對營養(yǎng)的要求也有了一定程度的改變。4、比較了A. solani抗、感菌株對滲透壓的敏感性,觀察了藥劑脅迫下其電導(dǎo)率及細胞內(nèi)相關(guān)物質(zhì)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：菌株對啶酰菌胺的抗藥性與對NaCl滲透壓的敏感性之間的極顯著相關(guān)(P0.01)。RM類和RVH類菌株適應(yīng)啶酰菌胺的能力明顯高于S類菌株,膜受損傷的程度相對較小,RH類菌株則明顯弱于S類菌株,膜受損傷的程度相對較大,可推斷RH類菌株有可能以加快藥劑在體內(nèi)的排泄來維持生長,而RM類及RVH類菌株則通過降低細胞膜透性以阻止藥劑浸入體內(nèi)來維持生長,并且在從中抗向高抗性發(fā)展的過程中,菌株的細胞膜或者胞內(nèi)物質(zhì)似乎發(fā)生了一些改變來應(yīng)對啶酰菌胺。R類菌株細胞內(nèi)可溶性糖含量明顯降低(P0.05),可溶性蛋白的含量明顯增加(P0.05),但沒隨著抗性的增加而呈現(xiàn)上升或下降的趨勢,R類菌株的可溶性蛋白種類比s類菌株的多出可能與抗藥性有關(guān)的Rf=0.06和Rf=0.45的特異性譜帶,且R類菌株中若干個可溶性蛋白的表達量增多；隨著A. solani對啶酰菌胺抗性的增加,細胞膜中甘油的含量逐漸降低。5、研究了A. solani抗、感菌株內(nèi)保護性酶類和SDH酶的活性,比較酯酶同工酶圖譜來明確抗、感菌株是否存在穩(wěn)定的特異性差異。研究表明：與S類菌株的相比,R類菌株的CAT、SOD和SDH活性明顯升高(P0.05)；在啶酰菌胺脅迫下,S類菌株的CAT和SOD活性明顯升高,但其活性隨著藥劑濃度的增加而明顯下降(P0.05),R類菌株的CAT和SOD活性則呈下降趨勢,但R類菌株的SOD活性始終高于S類菌株的,各供試菌株的SDH活性隨著藥劑濃度的增加而顯著受到抑制(P0.05)；且抗性水平越高的菌株,啶酰菌胺對其SDH活性的抑制效果越差。Rf=0.60和Rf=0.74的特異性酯酶同工酶譜帶為RH類和RVH類菌株所缺失,其所對應(yīng)的酶可能在菌株形成高水平抗性后表達上出現(xiàn)了差異。6、為了分析A. solani抗啶酰菌胺的分子機理,克隆了抗、感菌株的Sdh基因,翻譯成蛋白序列并進行比對。SDH復(fù)合體亞基的突變會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生過量的ROS,因此還測定了抗、感菌株ROS含量的變化,及在藥劑脅迫下的變化。本研究檢測出了RM菌株的SdhB亞基上除了已報道H278R突變外,還存在163T和K261M,RH菌株的SdhB亞基出現(xiàn)V245G和E263D突變,RVH菌株的SdhB亞基上出現(xiàn)S61L突變；未發(fā)現(xiàn)R類菌株的SdhC亞基存在突變；RH和RvH菌株SdhD也未發(fā)生突變,而RM菌株的SdhD亞基上出現(xiàn)T47A突變。該現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與本文菌株采集地與文獻中采集地的用藥策略不同有關(guān),也可能是菌株對其他殺菌劑產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致Sdh蛋白發(fā)生突變,還可能與菌株來源地的差異有關(guān)。R類菌株中ROS量比S類菌株的明顯增多；在啶酰菌胺系列濃度脅迫時,在相同的條件下,R類菌株ROS量始終明顯高于S類菌株的ROS量,但都呈下降趨勢,有可能是藥劑在抑制SDH復(fù)合體時也影響到了新陳代謝,同樣也影響了ROS的產(chǎn)生。另外,在SdhB、SdhC和SdhD上都發(fā)現(xiàn)了無義突變,至于這些無義突變是否會影響到ROS的產(chǎn)生有待于進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.412.14

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本文編號：1145135