本文關(guān)鍵詞：大豆疫霉菌階段發(fā)育和毒性變異相關(guān)小RNA的鑒定及分析

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【摘要】：病原菌嚴(yán)重影響植物的生存、生長(zhǎng)和生殖等,危害巨大。植物病原卵菌可造成毀滅性的作物生產(chǎn)損失,威脅自然生態(tài)系統(tǒng)。卵菌為二倍體真核微生物,其形態(tài)和生理上與絲狀真菌相似,但在進(jìn)化上與硅藻和褐藻更近,多數(shù)殺真菌劑對(duì)卵菌病害的防控?zé)o效。卵菌包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌和白銹菌等。引起愛(ài)爾蘭大饑荒的致病疫霉菌,每年仍可造成多達(dá)67億美元的經(jīng)濟(jì)損失。引起大豆幼苗倒伏或大豆根腐病的大豆疫霉菌,每年造成約10-20億美元的經(jīng)濟(jì)損失。作物病害最有效的防控依賴于抗病性的利用,然而病菌的遺傳變異,包括可能的表觀遺傳變異,頻頻引起作物抗病性喪失。許多研究者多次觀察到疫霉菌的表觀遺傳現(xiàn)象。小RNA分子,例如si RNA,mi RNA和pi RNA,可通過(guò)反義互補(bǔ)配對(duì)引起轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默,是真核生物重要的表觀遺傳調(diào)控分子。然而,我們對(duì)疫霉菌的小RNA的種類(lèi)、特征、功能和作用方式等知之甚少。為此,我們以大豆疫霉菌為模式,對(duì)其階段發(fā)育和毒性變異相關(guān)的小RNA進(jìn)行分析,主要研究結(jié)果如下:1、通過(guò)深度測(cè)序、計(jì)算機(jī)識(shí)別、傳統(tǒng)克隆和Northern雜交等方法,在大豆疫霉菌基因組中發(fā)現(xiàn)了大量ts RNA分子(t RNA來(lái)源的小RNA分子)。利用自主開(kāi)發(fā)的軟件ts RFinder對(duì)大豆疫霉菌營(yíng)養(yǎng)菌絲小RNA的重測(cè)序和Northern雜交分析結(jié)果表明,t RNA reads富集在29-36 nt,最高峰在33 nt,其5’第一個(gè)堿基偏好于堿基G,其次為T(mén)。在28-45 nt的小RNA中,t RNA reads高達(dá)12.34%,豐度最高的ts RNA-Gly CCC-5p占總reads的2.05%。2、基因組分析和Northern雜交分析表明,ts RNA是一類(lèi)保守的小RNA分子。Northern雜交分析還表明,其表達(dá)模式也相對(duì)保守:大多數(shù)ts RNA在卵孢子、營(yíng)養(yǎng)菌絲和孢子囊時(shí)期高表達(dá),在侵染和萌發(fā)的休止孢時(shí)期低表達(dá),而在休止孢時(shí)期幾乎不表達(dá)。通過(guò)生物信息分析,我們預(yù)測(cè)到多個(gè)ts RNA候選靶標(biāo)基因。數(shù)字基因表達(dá)譜、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR等結(jié)果表明,大部分候選靶標(biāo)基因表達(dá)模式與ts RNA的表達(dá)模式負(fù)相關(guān)。因此,疫霉菌ts RNA分子可調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。3、利用RNA定量和RLM-RACE技術(shù)(RNA連接介導(dǎo)的c DNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)),確認(rèn)并捕獲到5個(gè)靶標(biāo)基因在大豆疫霉菌菌絲中的降解產(chǎn)物。然而,這些ts RNA靶標(biāo)基因降解位點(diǎn)不在小RNA的結(jié)合位點(diǎn),與已知的mi RNA介導(dǎo)的靶基因降解機(jī)制差異較大。與RLM-RACE結(jié)果一致,高通量RNA末端并行測(cè)序表明,ts RNA可介導(dǎo)靶基因在鄰近結(jié)合位點(diǎn)的位置降解,略偏好于其結(jié)合位點(diǎn)下游區(qū)域。疫霉菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化分析表明,疫霉菌ts RNA可序列特異的抑制GUS人工靶標(biāo)基因的表達(dá)。因此,疫霉菌ts RNA分子可與靶標(biāo)基因反義匹配并引起m RNA降解。4、通過(guò)對(duì)大豆疫霉菌效應(yīng)基因Avr1b-1沉默菌株的小RNA深度測(cè)序和Northern雜交分析,發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)與Avr1b-1同源的小RNA分子:即Avr1b-1沉默的觸發(fā)子Avr1b-1-s RNA和沉默信號(hào)Avr1b-1-si RNAs。雜交結(jié)果還表明,這兩類(lèi)小RNA都在毒性菌株中累積,而在無(wú)毒菌株中不累積。其中,觸發(fā)子Avr1b-1-s RNA比沉默信號(hào)Avr1b-1-si RNAs的累積早12-24小時(shí)。進(jìn)一步的生物信息分析和Northern雜交分析表明,大豆疫霉菌中存在大量與RXLR效應(yīng)蛋白基因同源的小RNA分子,并且RXLR基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。5、基因組分析和反轉(zhuǎn)錄PCR數(shù)據(jù)表明,Avr1b-1位點(diǎn)是雙向轉(zhuǎn)錄的,其形成的天然反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)為Avr1b-1-s RNA的前體,并通過(guò)其產(chǎn)物觸發(fā)子Avr1b-1-s RNA來(lái)調(diào)控?zé)o毒基因Avr1b-1的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄PCR數(shù)據(jù)還表明,Avr1b-1反義鏈Avr1b-1(-)的差異表達(dá)對(duì)觸發(fā)子Avr1b-1-s RNA在毒性菌株和無(wú)毒菌株間的差異累積負(fù)責(zé)。進(jìn)一步的序列分析表明,Avr1b-1(+)和Avr1b-1(-)的表達(dá)水平與其啟動(dòng)子中10 nt左右INDEL(插入和缺失變異)的存在和缺失相關(guān)聯(lián)。
【關(guān)鍵詞】：大豆疫霉菌 階段發(fā)育 毒性變異 小RNA 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S435.651
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-38
• 1.1 植物病原卵菌13-14
• 1.2 重要的疫霉菌及其危害14-15
• 1.3 疫霉菌的遺傳學(xué)與生物學(xué)15-20
• 1.3.1 疫霉菌的生活史15-17
• 1.3.2 疫霉菌的遺傳與變異17-18
• 1.3.3 疫霉菌的遺傳操作18
• 1.3.4 疫霉菌無(wú)毒基因的克隆18-20
• 1.4 疫霉菌的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)20-23
• 1.4.1 疫霉菌的基因組學(xué)20-22
• 1.4.2 疫霉菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)22-23
• 1.5 疫霉菌-植物互作23-26
• 1.5.1 疫霉菌的效應(yīng)蛋白23-24
• 1.5.2 植物免疫系統(tǒng)24-26
• 1.6 小RNA與基因沉默26-35
• 1.6.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)26-27
• 1.6.2 siRNA的發(fā)現(xiàn)、加工和作用方式27-29
• 1.6.3 miRNA的發(fā)現(xiàn)、加工和作用方式29-31
• 1.6.4 piRNA的發(fā)現(xiàn)、加工和作用方式31-33
• 1.6.5 tRNA來(lái)源小RNA的研究進(jìn)展33-35
• 1.6.6 小RNA在植物病原互作過(guò)程中的作用35
• 1.7 疫霉菌小RNA的研究概況35-36
• 1.8 本研究的目的和意義36-38
• 第二章 卵菌編碼具有功能的tRNA來(lái)源的小RNA分子38-72
• 2.1 背景簡(jiǎn)介38-39
• 2.2 結(jié)果與分析39-63
• 2.2.1 大豆疫霉菌tsRNA的鑒定39-44
• 2.2.2 大豆疫霉菌tsRNA的Northern驗(yàn)證及其保守性分析44-46
• 2.2.3 大豆疫霉菌tsRNA的表達(dá)分析46-50
• 2.2.4 大豆疫霉菌tsRNA靶標(biāo)基因的確定50-53
• 2.2.5 tsRNA的累積與靶標(biāo)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)53-56
• 2.2.6 tsRNA介導(dǎo)靶標(biāo)基因在結(jié)合位點(diǎn)附近的多個(gè)位點(diǎn)降解56-62
• 2.2.7 tsRNA結(jié)合位點(diǎn)對(duì)抑制靶標(biāo)基因表達(dá)至關(guān)重要62-63
• 2.3 討論63-68
• 2.4 材料與方法68-72
• 2.4.1 大豆疫霉菌菌株、培養(yǎng)以及接菌條件68-69
• 2.4.2 RNA提取69
• 2.4.3 深度測(cè)序69
• 2.4.4 小RNA克隆69
• 2.4.5 Northern雜交分析69-70
• 2.4.6 RNA定量分析70
• 2.4.7 RLM RACE分析70
• 2.4.8 GUS感知器分析70-71
• 2.4.9 計(jì)算分析71-72
• 第三章 tsRFinder的開(kāi)發(fā)及大豆疫霉菌tsRNA的重測(cè)序72-92
• 3.1 背景簡(jiǎn)介72-73
• 3.2 結(jié)果與分析73-88
• 3.2.1 tsRFinder的框架及模塊73-75
• 3.2.2 tsRFinder的使用75-77
• 3.2.3 tsRFinder的應(yīng)用例子：擬南芥中的tsRNA77-78
• 3.2.4 大豆疫霉菌小RNA的重測(cè)序78-87
• 3.2.5 降解組輔助的大豆疫霉菌tsRNA靶標(biāo)分析87-88
• 3.3 討論88-90
• 3.4 材料與方法90-92
• 3.4.1 tsRFinder的開(kāi)發(fā)與調(diào)試90
• 3.4.2 大豆疫霉菌重測(cè)序數(shù)據(jù)的獲得與分析90-91
• 3.4.3 大豆疫霉菌tsRNA的Northern雜交91
• 3.4.4 降解組輔助的靶基因的分析91-92
• 第四章 大豆疫霉菌中小RNA介導(dǎo)的RXLR基因沉默92-110
• 4.1 背景簡(jiǎn)介92-93
• 4.2 結(jié)果與分析93-104
• 4.2.1 Avr1b-1-sRNA的發(fā)現(xiàn)93-94
• 4.2.2 Avr1b-1-sRNA引發(fā)的基因沉默信號(hào)只在毒性菌株中累積94-96
• 4.2.3 小RNA與大量RXLR效應(yīng)蛋白基因表達(dá)相關(guān)96-98
• 4.2.4 雙向轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的Avr1b-1-sRNA的產(chǎn)生98-100
• 4.2.5 啟動(dòng)子的短序列變異與Avr1b-1和Avr1b-1-sRNA的轉(zhuǎn)錄相關(guān)聯(lián)100-102
• 4.2.6 啟動(dòng)子區(qū)域短序列插入/缺失變異廣泛存在且受自然選擇102-104
• 4.3 討論104-108
• 4.4 材料與方法108-110
• 4.4.1 生物信息學(xué)分析108
• 4.4.2 大豆疫霉菌菌株及其培養(yǎng)108
• 4.4.3 大豆幼苗的接菌108-109
• 4.4.4 疫霉菌及植物RNA的提取109
• 4.4.5 Northern雜交試驗(yàn)109
• 4.4.6 RT-PCR分析109-110
• 第五章 結(jié)論110-113
• 5.1 結(jié)論110-111
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)111-112
• 5.3 展望112-113
• 參考文獻(xiàn)113-145
• 附錄145-148
• 致謝148-149
• 作者簡(jiǎn)介149-150

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本文編號(hào)：1132095