本文關(guān)鍵詞：魚類淋巴囊腫病毒感染對(duì)27.8kDa受體表達(dá)及牙鲆鰓轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的影響

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【摘要】：淋巴囊腫病是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要病毒性疾病之一,已知可感染超過(guò)42科140種以上的淡水、半咸水和海水魚類。淋巴囊腫病毒(lymphocystis disease virus, LCDV)為該病的病原,在我國(guó)養(yǎng)殖的牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和花鱸(Lateolabrax japonicus)等經(jīng)濟(jì)魚類中流行較為廣泛。研究表明LCDV是通過(guò)受體介導(dǎo)作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期曾在牙鲆鰓細(xì)胞系(FG)上鑒定出一個(gè)27.8kDa受體蛋白與LCDV感染有關(guān),并制備了抗27.8kDa受體蛋白的單克隆抗體。本文在牙鲆FG細(xì)胞和胚胎細(xì)胞(HINAE)上分析了LCDV感染與27.8kDa受體蛋白表達(dá)的相互關(guān)系；研究了該受體蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鱸中的組織分布及LCDV感染誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)；探究了27.8kDa受體蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白細(xì)胞的作用,研究結(jié)果促進(jìn)了對(duì)LCDV侵染機(jī)制及傳播途徑的認(rèn)識(shí)；通過(guò)RNA-seq分析了LCDV感染后牙鲆鰓轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化,為揭示LCDV致病機(jī)理提供重要數(shù)據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：(1)牙鲆FG和HINAE細(xì)胞上27.8kDa受體蛋白表達(dá)與LCDV感染的相互關(guān)系研究。蛋白免疫印跡表明,抗27.8kDa受體蛋白單抗可以特異性地結(jié)合FG和HINAE細(xì)胞膜蛋白中的一條分子量為27.8kDa的蛋白；病毒受體共熒光染色發(fā)現(xiàn),27.8kDa受體表達(dá)于FG和HINAE細(xì)胞表面,并與LCDV共定位；病毒感染后,細(xì)胞中受體蛋白的表達(dá)通過(guò)雙抗夾心ELISA進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)受體蛋白表達(dá)水平與病毒滴度呈正相關(guān)；感染9天期間,細(xì)胞中受體蛋白表達(dá)呈先上升后下降趨勢(shì)；感染期間,細(xì)胞中LCDV載量通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),病毒的增殖規(guī)律與受體蛋白類似,但是其峰值出現(xiàn)時(shí)間比受體蛋白要晚。感染過(guò)程各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn),FG細(xì)胞中27.8kDa受體蛋白和LCDV載量都比HINAE細(xì)胞高。單抗阻斷實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)增加抗27.8kDa受體蛋白單抗?jié)舛?感染后細(xì)胞中27.8kDa受體蛋白的上調(diào)表達(dá)和LCDV增殖會(huì)受到明顯抑制,體外感染實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)的細(xì)胞病變也明顯減少。這些結(jié)果表明,預(yù)封閉抗27.8kDa受體蛋白單抗可以抑制感染后細(xì)胞受體的表達(dá)及病毒增殖。本項(xiàng)研究表明,LCDV感染后可以引發(fā)細(xì)胞中27.8kDa受體出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),從而又增加了細(xì)胞對(duì)于LCDV的易感性。(2)27.8kDa受體蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鱸的組織分布及LCDV感染后的表達(dá)動(dòng)態(tài)。以抗27.8kDa受體蛋白單抗為檢測(cè)探針,利用間接免疫熒光和免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)三種健康魚的鰓、胃、腸、皮膚、腦、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、體腎和性腺進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明所檢測(cè)的組織中都有27.8kDa受體蛋白的陽(yáng)性信號(hào)：利用間接ELISA檢測(cè)組織中27.8kDa受體蛋白的表達(dá),該受體在健康牙鲆鰓和胃中表達(dá)最高,在體腎中表達(dá)最低；在大菱鲆中,該受體表達(dá)在胃、鰓、心臟和腸中表達(dá)相對(duì)較高,在卵巢和腦中表達(dá)相對(duì)較低；在花鱸中,受體表達(dá)在鰓和表皮中表達(dá)相對(duì)較高,在體腎和腦中表達(dá)相對(duì)較低。病毒感染后,組織中27.8kDa受體蛋白表達(dá)呈上調(diào)表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,病毒拷貝數(shù)隨著時(shí)間進(jìn)程而逐漸增多,且較高的LCDV載量一般出現(xiàn)在感染前受體表達(dá)量較高的組織。用感染后的血細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè),結(jié)果表明,紅細(xì)胞中沒(méi)有27.8kDa受體蛋白和LCDV陽(yáng)性信號(hào),但是某些白細(xì)胞亞群中有兩者的陽(yáng)性信號(hào)。本研究表明,來(lái)源于牙鲆的27.8kDa受體蛋白也在大菱鲆和花鱸感染LCDV中扮演受體蛋白角色,外周血白細(xì)胞對(duì)病毒的易感性可能導(dǎo)致LCDV在體內(nèi)的全身感染；LCDV在牙鲆、大菱鲆和花鱸中存在垂直傳播的可能。這些數(shù)據(jù)有助于理解淋巴囊腫致病機(jī)理和在魚類的傳播途徑。(3)27.8kDa受體蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白細(xì)胞的意義。本研究通過(guò)定位感染病毒后外周血27.8kDa受體蛋白及LCDV的分布來(lái)分析LCDV的血液傳播。感染3小時(shí)后,在牙鲆紅細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到27.8kDa受體蛋白和LCDV的陽(yáng)性信號(hào),但是在部分白細(xì)胞中出現(xiàn)了兩者的陽(yáng)性信號(hào)。免疫電鏡證實(shí),細(xì)胞膜表面確實(shí)由27.8kDa受體蛋白分布;流式細(xì)胞術(shù)表明,白細(xì)胞中27.8kDa受體蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率為14.28%。透射電鏡下,對(duì)白細(xì)胞體外感染LCDV的超薄切片進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染病毒1小時(shí)后,病毒吸附于白細(xì)胞膜上,而感染36小時(shí)后,細(xì)胞中LCDV復(fù)制則非常充分。多熒光染色實(shí)驗(yàn)表明：1)白細(xì)胞上27.8kDa受體蛋白和LCDV陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)共定位于部分白細(xì)胞表面；2)CD3陽(yáng)性細(xì)胞與LCDV陽(yáng)性細(xì)胞不交叉；(3)所有的IgM和IgD陽(yáng)性細(xì)胞都對(duì)LCDV易感。本研究表明,27.8kDa受體表達(dá)于部分白細(xì)胞表面,導(dǎo)致這些細(xì)胞對(duì)LCDV易感,IgM+和IgD+白細(xì)胞很可能參與了LCDV的血液傳播。(4)牙鲆感染LCDV后鰓組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。牙鲆感染LCDV一周后,采用RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)分析鰓中的差異表達(dá)基因。選取感染和未感染LCDV的鰓組織RNA,通過(guò)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行混合測(cè)序。測(cè)序后共獲得193,225,170個(gè)clean reads,拼接組裝后得到106,293個(gè)unigenes,其中36,537個(gè)(34.37%)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)被成功注釋。分析感染前后基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),感染后共有1812個(gè)基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),1626個(gè)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá),這些差異基因富集于14個(gè)Gene Ontology子集和22條信號(hào)通路。對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),它們參與了炎癥反應(yīng)、泛素-蛋白酶體通路、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成及抗病毒感染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明,RNA-seq結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本項(xiàng)研究數(shù)據(jù)不僅有助于鑒定與發(fā)現(xiàn)牙鲆新基因,并首次對(duì)于LCDV感染早期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)答進(jìn)行了分析。
【關(guān)鍵詞】：淋巴囊腫病毒 27.8kDa受體 受體表達(dá)動(dòng)態(tài) 病毒傳播途徑 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 病毒致病機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S943
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abshacrt8-16
• 1. 前言16-32
• 1.1 牙鲆淋巴囊腫病毒的研究進(jìn)展16-20
• 1.1.1 魚類淋巴囊腫病流行規(guī)律概述16
• 1.1.2 LCD的病理學(xué)研究16-17
• 1.1.3 魚體對(duì)LCDV感染的免疫應(yīng)答17
• 1.1.4 LCDV分子結(jié)構(gòu)17
• 1.1.5 LCDV傳播途徑研究17-18
• 1.1.6 LCDV的體外培養(yǎng)方法18
• 1.1.7 LCD的診斷學(xué)研究18-19
• 1.1.8 LCD的防治方法19-20
• 1.2 動(dòng)物病毒受體研究方法概述20-27
• 1.2.1 病毒受體的生物學(xué)特性20
• 1.2.2 病毒受體研究方法20-25
• 1.2.3 水生動(dòng)物病毒受體的研究進(jìn)展25-26
• 1.2.4 27.8kDa受體蛋白的研究進(jìn)展26-27
• 1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在動(dòng)物病毒性疾病研究中的應(yīng)用27-31
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)介紹27
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究常用技術(shù)介紹27-29
• 1.3.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在動(dòng)物病毒性疾病研究中的應(yīng)用29-31
• 1.4 本論文的研究目的及意義31-32
• 2. 牙鲆FG和HINAE細(xì)胞上27.8 kDa受體蛋白表達(dá)與LCDV感染的動(dòng)態(tài)關(guān)系32-54
• 2.1 牙鲆鰓細(xì)胞和胚胎細(xì)胞培養(yǎng)及LCDV提純32-38
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑32-33
• 2.1.2 方法33-34
• 2.1.3 結(jié)果34-37
• 2.1.4 討論37-38
• 2.2 牙鲆27.8kDa受體蛋白與LCDV相互作用關(guān)系研究38-52
• 2.2.1 材料與儀器38
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法38-43
• 2.2.3 結(jié)果43-52
• 2.2.4 討論52
• 本椝小結(jié)52-54
• 3. 27.8kDa受體蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鱸的組織分布及LCDV感染后的表達(dá)動(dòng)態(tài)研究54-82
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器54-55
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象54
• 3.1.2 試劑及儀器54-55
• 3.2 方法55-60
• 3.2.1 組織冰凍切片的制備55
• 3.2.2 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IIFA)55
• 3.2.3 石蠟切片的制備55-57
• 3.2.4 免疫組織化學(xué)染色(IHC)57-58
• 3.2.5 病毒感染及取樣58-59
• 3.2.6 間接ELISA59-60
• 3.2.7 絕對(duì)熒光定量PCR60
• 3.2.8 血細(xì)胞中受體和病毒的分布60
• 3.3 結(jié)果60-80
• 3.3.1 間接免疫熒光定位27.8kDa受體蛋白的分布60-63
• 3.3.2 免疫組織化學(xué)染色定位27.8kDa受體蛋白的分布63-66
• 3.3.3 組織中27.8kDa受體蛋白感染病毒后的表達(dá)動(dòng)態(tài)66-71
• 3.3.4 病毒感染后組織中LCDV粒子的變化動(dòng)態(tài)71-77
• 3.3.5 感染后血細(xì)胞中病毒與27.8kDa受體蛋白的檢測(cè)77-80
• 3.4 討論80-81
• 本章小結(jié)81-82
• 4. 27.8kDa受體蛋白在LCDV感染牙鲆白細(xì)胞的意義82-94
• 4.1 材料與儀器82-83
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料82
• 4.1.2 試劑與儀器82-83
• 4.2 方法83-86
• 4.2.1 感染后牙鲆血細(xì)胞中LCDV與27.8 kDa受體蛋白檢測(cè)83
• 4.2.2 免疫電鏡83-84
• 4.2.3 流式細(xì)胞術(shù)84
• 4.2.4 LCDV體外感染牙鲆白細(xì)胞及電鏡觀察84-85
• 4.2.5 多熒光免疫染色85-86
• 4.3 結(jié)果86-91
• 4.3.1 感染病毒后全血細(xì)胞中27.8kDa受體及LCDV分布86
• 4.3.2 牙鲆外周血白細(xì)胞的采集86-87
• 4.3.3 免疫電鏡87
• 4.3.4 流式細(xì)胞術(shù)87-88
• 4.3.5 LCDV體外感染白細(xì)胞的時(shí)間進(jìn)程88-89
• 4.3.6 27.8kDa受體蛋白在LCDV感染白細(xì)胞中的作用89-90
• 4.3.7 CD3、IgM和IgD陽(yáng)性白細(xì)胞的LCDV易感性檢測(cè)90-91
• 4.4 討論91-93
• 本章小結(jié)93-94
• 5. 牙鲆感染LCDV后鰓組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究94-119
• 5.1 材料與儀器94-95
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與病毒94
• 5.1.2 試劑與儀器94-95
• 5.2 方法95-99
• 5.2.1 牙鲆攻毒實(shí)驗(yàn)95
• 5.2.2 RNA提取95-96
• 5.2.3 RNA質(zhì)量檢測(cè)96
• 5.2.4 文庫(kù)構(gòu)建、庫(kù)檢及上機(jī)測(cè)序96-97
• 5.2.5 生物信息學(xué)分析流程97
• 5.2.6 RNA-Seq數(shù)據(jù)的驗(yàn)證97-99
• 5.3 結(jié)果99-115
• 5.3.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)99-100
• 5.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總100
• 5.3.3 拼接轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度分布100-101
• 5.3.4 基因功能注釋101-104
• 5.3.5 CDS預(yù)測(cè)104-106
• 5.3.6 基因表達(dá)水平及差異基因分析106-110
• 5.3.7 差異表達(dá)基因的GO分類110-111
• 5.3.8 差異表達(dá)基因的KEGG分析111-112
• 5.3.9 病毒入侵及機(jī)體免疫應(yīng)對(duì)感染的相關(guān)基因112-114
• 5.3.10 RNA-seq結(jié)果的qPCR驗(yàn)證114-115
• 5.4 討論115-118
• 5.4.1 LCDV 27.8 kDa受體蛋白基因的差異表達(dá)116
• 5.4.2 差異表達(dá)的細(xì)胞因子及相關(guān)基因116-117
• 5.4.3 Toll樣受體的應(yīng)答變化117
• 5.4.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化117
• 5.4.5 獲得性免疫相關(guān)基因117
• 5.4.6 其他抗LCDV感染基因117-118
• 本章小結(jié)118-119
• 總結(jié)119-121
• 參考文獻(xiàn)121-133
• 致謝133-134
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷134
• 研究生期間的學(xué)術(shù)成果134

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本文編號(hào)：1089620