目的:構建H37Ra Hsp16.3基因敲除菌株以及回補菌株,研究Hsp16.3在H37Ra菌株中的功能,并觀察該基因敲除菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞炎性細胞因子表達,趨化功能以及抗原呈遞功能的影響。方法:1.通過同源重組技術構建Hsp X基因敲除菌株（MUT）;向MUT菌株電轉化p MV261-Hsp X質粒構建Hsp X基因敲除回補菌株（COMP）。2.通過對比野生型菌株（WT）、COMP和MUT菌株的菌落特征和生長速率來觀察Hsp16.3的缺失對H37Ra菌株的影響。3.構建體外WT、COMP和MUT菌株感染巨噬細胞的潛伏感染模型。在該模型構建成功后繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h,Real-time PCR檢測巨噬細胞炎性細胞因子i NOS、IL-6和TNF-α基因表達水平,Western-blot檢測i NOS的蛋白表達水平,ELISA檢測IL-6和TNF-α蛋白表達水平。4.通過transwell實驗檢測Hsp16.3對巨噬細胞趨化功能的影響,Real-time PCR檢測趨化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12基因表達水平,FCM檢測F4/80+CCR1+、F4/80...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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英文摘要
前言
第一部分
    1 材料與方法
        1.1 主要實驗材料和試劑
            1.1.1 質粒與菌株
            1.1.2 引物
            1.1.3 培養(yǎng)基及緩沖液配置
            1.1.4 試劑耗材
            1.1.5 儀器耗材
        1.2 實驗方法
            1.2.1 培養(yǎng)方法及保存
            1.2.2 p0004s-AES質粒構建
            1.2.3 phAE159-AES質粒構建
            1.2.4 制備噬菌體
            1.2.5 噬菌體裂解液轉染待敲除菌株
            1.2.6 制備結核分枝桿菌電轉化態(tài)
            1.2.7 電擊轉化結核分支桿菌感受態(tài)細胞
            1.2.8 HspX基因缺失菌株以及回補菌株的鑒定
                1.2.8.1 菌株蛋白制備
                1.2.8.2 Western-blot檢測菌株Hsp16.3 的表達
                    1.2.8.2.1 試劑配置
                    1.2.8.2.2 實驗步驟
            1.2.9 生長曲線的測定
            1.2.10 菌落形態(tài)觀察
        1.3 統(tǒng)計學方法
    2 結果
        2.1 HspX基因敲除菌株的構建
            2.1.1 基因敲除相關引物設計序列定位
            2.1.2 PCR擴增左右臂
            2.1.3 噬菌粒的構建
            2.1.4 構建分枝桿菌噬菌體
            2.1.5 結核分枝桿菌H37Ra HspX基因敲除菌株(MUT)的構建
        2.2 PCR驗證結核分枝桿菌H37Ra HspX基因敲除菌株
        2.3 結核分枝桿菌H37Ra HspX基因回補菌株(COMP)的構建
        2.4 菌株Hsp16.3表達的檢測
        2.5 菌株生長曲線測定
        2.6 MUT菌株菌落形態(tài)
    3 討論
第二部分
    1 材料與方法
        1.1 主要實驗材料和試劑
            1.1.1 實驗動物
            1.1.2 實驗試劑
            1.1.3 實驗儀器
        1.2 方法
            1.2.1 小鼠骨髓來源巨噬細胞的誘導及培養(yǎng)
            1.2.2 CD4⁺T細胞提取及刺激
            1.2.3 制作巨噬細胞細胞爬片
            1.2.4 吞噬率檢測
            1.2.5 體外潛伏感染模型的構建
            1.2.6 熒光定量PCR檢測細胞因子基因表達水平
                1.2.6.1 總RNA的提取
                1.2.6.2 RNA逆轉錄為cDNA
                1.2.6.3 實時熒光定量PCR引物設計列表
                1.2.6.4 實時熒光定量PCR檢測體系及其條件
            1.2.7 ELISA檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中的細胞因子
                1.2.7.1 樣品及試劑準備
                1.2.7.2 檢測
            1.2.8 Western-blot檢測巨噬細胞蛋白表達
            1.2.9 流式細胞術檢測巨噬細胞相關分子表達水平
            1.2.10 transwell實驗
        1.3 統(tǒng)計學分析
    2 結果
        2.1 BMDM的誘導成熟
        2.2 小鼠骨髓來源巨噬細胞對 MUT 菌株的吞噬率檢測
        2.3 小鼠骨髓來源巨噬細胞在不同MOI下受感染情況
        2.4 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞炎性細胞因子m RNA表達的影響
        2.5 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞炎性細胞因子表達的影響
        2.6 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞趨化功能的影響
        2.7 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞抗原提呈功能的影響
            2.7.1 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞吞噬體-溶酶體的影響
            2.7.2 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞MHCⅡ表達的影響
            2.7.3 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞CIITA及其轉錄因子表達的影響
            2.7.4 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞和CD4+T細胞共培養(yǎng)體系中IFN-γ和IL-10 表達的影響
            2.7.5 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞p-STAT1/p-STAT3表達的影響
        2.8 MUT菌株對小鼠骨髓來源巨噬細胞胞內殺傷功能的影響
    3 討論
結論
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：4023058