目前臨床治療癌癥的常用方式包括手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)療法,但這三種方法對(duì)于治療晚期癌癥仍收效甚微,因此尋求新的治療手段迫在眉睫。鑒于嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞在血液瘤治療上獲得了顯著的臨床療效,近年來(lái)將這一技術(shù)應(yīng)用于實(shí)體瘤治療已逐漸成為研究熱點(diǎn)。然而由于腫瘤免疫抑制微環(huán)境等多種因素的影響,導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞在治療實(shí)體瘤過(guò)程中的療效受到限制,因此大量研究致力于對(duì)CAR各個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,以有效提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功效。T細(xì)胞的活化需要多種信號(hào)的參與,包括抗原激活信號(hào)（第一信號(hào)）、共刺激分子信號(hào)（第二信號(hào)）及細(xì)胞因子信號(hào)（第三信號(hào)）,但是目前臨床使用的CAR-T胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中普遍缺乏細(xì)胞因子提供的第三信號(hào),同時(shí)在腫瘤微環(huán)境中大多為T(mén)GF-β、IL-10等抑制信號(hào),因此CAR結(jié)構(gòu)的優(yōu)化方向之一逐漸集中于為CAR-T細(xì)胞提供額外的激活性細(xì)胞因子信號(hào)。IL-12作為一種Th1型細(xì)胞因子,是T細(xì)胞活化、分化過(guò)程中經(jīng)典的激活性第三信號(hào),被認(rèn)為是機(jī)體抵抗腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要效應(yīng)分子,已逐步嘗試應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療。目前已經(jīng)構(gòu)建能在局部釋放IL-12的CAR-T細(xì)胞,然而由于IL-12分泌水平...

【文章頁(yè)數(shù)】：96 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 課題背景
        1.1.1 癌癥治療現(xiàn)狀
        1.1.2 CAR-T細(xì)胞療法的現(xiàn)狀
        1.1.3 CAR-T治療實(shí)體瘤的挑戰(zhàn)
        1.1.4 CAR結(jié)構(gòu)針對(duì)實(shí)體瘤的優(yōu)化
        1.1.5 IL-12 的抗腫瘤機(jī)制
        1.1.6 IL-12 在CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)化的應(yīng)用
        1.1.7 IL-12R及其下游信號(hào)
    1.2 課題意義及研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 慢病毒質(zhì)粒
        2.1.3 常用溶液及配方
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)耗材及試劑
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1α-CAR-T
        2.2.3 慢病毒包裝
        2.2.4 人外周血單核細(xì)胞分離純化及激活
        2.2.5 制備CAR-T細(xì)胞
        2.2.6 構(gòu)建PSMA+-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株
        2.2.7 流式細(xì)胞術(shù)
        2.2.8 CAR-T細(xì)胞體外抗腫瘤效應(yīng)
        2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1α-CAR-T
        3.1.1 PSMA/CD19-CAR結(jié)構(gòu)
        3.1.2 鑒定重組慢病毒表達(dá)載體
        3.1.3 小結(jié)
    3.2 制備PSMA/CD19-CAR-T細(xì)胞
        3.2.1 慢病毒滴度檢測(cè)
        3.2.2 T細(xì)胞中CAR的轉(zhuǎn)導(dǎo)及表達(dá)
        3.2.3 小結(jié)
    3.3 構(gòu)建PSMA⁺-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株
        3.3.1 PSMA⁺-Luciferase-PC-3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定
        3.3.2 小結(jié)
    3.4 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CAR-T活化的影響
        3.4.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段CAR-T能誘導(dǎo)蛋白STAT4磷酸化
        3.4.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段能促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的激活
        3.4.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CAR-T細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響
        3.4.4 小結(jié)
    3.5 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CAR-T分型的影響
        3.5.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CD4⁺/CD8⁺細(xì)胞比例無(wú)顯著影響
        3.5.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段能提高T_EM細(xì)胞比例
        3.5.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CAR-T細(xì)胞的耗竭無(wú)顯著影響
        3.5.4 小結(jié)
    3.6 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段對(duì)CAR-T效應(yīng)功能的影響
        3.6.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段可促進(jìn)TNF-α 和IFN-γ 的分泌
        3.6.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞內(nèi)段可提高CAR-T細(xì)胞的殺傷能力
        3.6.3 小結(jié)
第四章 討論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 縮略詞表
致謝



本文編號(hào)：4021430