目的:本研究根據(jù)課題組前期建立的免疫程序制備抗rTgPRF多克隆抗體并體外監(jiān)測其對正常細胞及弓形蟲感染細胞生長、壞死和凋亡的影響。通過體內(nèi)實驗評價rTgPRF脂質(zhì)體或rTgPRF聯(lián)合弗氏佐劑免疫C57BL/6J小鼠后特異性抗體及CD4+/CD8+的變化,并進一步評估兩種免疫方式對弓形蟲感染小鼠的生存期、組織病理、生殖激素、細胞因子以及凋亡相關(guān)蛋白水平的影響,進而探討rTgPRF疫苗的保護效力及機制,為其進一步的應(yīng)用開發(fā)提供理論支撐和實驗依據(jù)。方法:將pET30a(+)-TgPRF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中大量表達rTgPRF蛋白,通過AKTA系統(tǒng)經(jīng)Ni柱和陰離子柱純化后冷凍干燥。首先,制備抗rTgPRF多克隆抗體并檢測其體外活性,將BALB/C-3T3成纖維細胞進行鋪板后分別加入抗rTgPRF血清(1:40)或兔免疫前血清(1:40),正常對照僅補充培養(yǎng)基,用Incucyte Zoom^TM系統(tǒng)間隔1 h動態(tài)監(jiān)測抗rTgPRF抗體對正常細胞生長、壞死和凋亡的影響�？箁TgPRF抗體對弓形蟲感染細胞的影響同樣進行了檢測,將細胞鋪板后預(yù)培養(yǎng)12 h,未感...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1rTgPRF蛋白AKTA純化峰值圖注：A：His-親和層析純化；B：Q離子柱交換層析純化；紅色圓圈標記為目的蛋白峰Fig.1rTgPRFproteinAKTApurificationpeakdiagramNote:A:His-affinitychromatographypurification;B:PurificationbyQ-ion-exchangechromatography;Redcirclemarkedastargetprotein

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文郭珊珊303結(jié)果3.1rTgPRF蛋白表達純化及凍干對重組蛋白進行His-親和層析純化洗脫可發(fā)現(xiàn)當洗脫液濃度依次為7%、15%、50%時各出現(xiàn)一峰(圖1A)，收集蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示，15%處所收集蛋白大小約為23kD(圖2A)，為目的....

圖2rTgPRF蛋白SDS-PAGE電泳圖A:未凍干蛋白，B:凍干蛋白；M:蛋白分子量標準，rTgPRF:蛋白Fig.2SDS-PAGEelectrophoresisofrTgPRFproteinA:Nonlyophilizedprotein,B:lyophilized

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文郭珊珊31圖2rTgPRF蛋白SDS-PAGE電泳圖A:未凍干蛋白，B:凍干蛋白；M:蛋白分子量標準，rTgPRF:蛋白Fig.2SDS-PAGEelectrophoresisofrTgPRFproteinA:Nonlyophilizedprotein,B....

圖3抗rTgPRF抗體作用細胞后細胞生長(A)、壞死(B)及凋亡(C)注：*表示P<0.05Fig.3Cellgrowth(A)、necrosis(B)andapoptosis(C)afterantirTgPRFantibodytreatment

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文郭珊珊32圖3抗rTgPRF抗體作用細胞后細胞生長(A)、壞死(B)及凋亡(C)注：*表示P<0.05Fig.3Cellgrowth(A)、necrosis(B)andapoptosis(C)afterantirTgPRFantibodytreatment....

圖4體外培養(yǎng)BALB/C-3T3成纖維細胞84h壞死和凋亡的熒光圖注：細胞壞死用YOYO-1探針標記為紅色熒光；凋亡用Caspase-3/7探針標記為綠色熒光

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文郭珊珊32圖3抗rTgPRF抗體作用細胞后細胞生長(A)、壞死(B)及凋亡(C)注：*表示P<0.05Fig.3Cellgrowth(A)、necrosis(B)andapoptosis(C)afterantirTgPRFantibodytreatment....

本文編號：3978556