人55型腺病毒(HAdV55)是近年來發(fā)現的由HAdV11與HAdV14重組而來的新型B種腺病毒。由于HAdV55在人群中的預存免疫普遍較低,容易在人群密集的地方如醫(yī)院、軍隊、學校等地爆發(fā),可致重癥呼吸道疾病甚至死亡,給社會帶來嚴重危害。為減少HAdV55爆發(fā)帶來的危害,我們亟需一種能夠有效阻止其在人群中傳播的藥物�？贵w是指在抗原刺激下由漿細胞產生的一種呈Y字型、對機體具有保護作用的蛋白質,單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的抗體,具有高度均一、僅能針對某一特定抗原表位的特點�？贵w與相應抗原結合之后可以阻斷抗原對機體的感染,在臨床上廣泛用于疾病的診斷、治療及預防,而目前針對可引起嚴重暴發(fā)感染的HAdV55抗體制備的相關研究報道很少,因此本課題擬在本實驗室已有HAdV55候選疫苗及HAdV14-55高變區(qū)嵌合病毒的基礎上,利用單細胞PCR技術,從免疫獼猴中克隆出HAdV55特異性的單克隆抗體,并進行活性分析和表位分析。本論文的主要研究工作概括如下:研究目的獲得具有良好結合、中和作用的HAdV55單克隆抗體,以期用于HAdV55的治療;鑒定抗體與HAdV55的結合表位與中和表位,以期為HAd...

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【學位級別】：碩士

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摘要
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第1章 引言
    1.1 腺病毒概述
        1.1.1 腺病毒簡介
        1.1.2 腺病毒感染機制
        1.1.3 腺病毒載體
        1.1.4 HAdV55及其親本腺病毒
    1.2 單克隆抗體
        1.2.1 單克隆抗體制備方法
        1.2.2 抗體藥物在治療病毒感染上的應用
        1.2.3 腺病毒單克隆抗體作用機制
第2章 單個B細胞克隆法篩選HAdV55中和抗體
    2.1 實驗材料
        2.1.1 分子克隆常用試劑
        2.1.2 蛋白質電泳相關試劑
        2.1.3 細胞培養(yǎng)和質粒轉染相關試劑
        2.1.4 ELISA相關試劑
        2.1.5 中和實驗相關試劑
    2.2 實驗分析及作圖軟件
    2.3 實驗相關儀
    2.4 實驗方法
        2.4.1 HAdV55候選疫苗免疫中國獼猴
        2.4.2 分離免疫獼猴外周血單個核細胞
        2.4.3 流式分選 HAd V55 特異性記憶細胞
        2.4.4 逆轉錄及單細胞 PCR 擴增抗體基因片段
        2.4.5 抗體基因克隆
        2.4.6 線性化載體制備
        2.4.7 抗體基因與對應載體連接
        2.4.8 連接產物轉化
        2.4.9 菌液 PCR 鑒定陽性克隆
        2.4.10 測序結果分析
        2.4.11 抗體基因在293T細胞中的表達
        2.4.12 考馬斯亮藍染色檢測抗體表達
        2.4.13 ELISA 檢測抗體與 HAd V55 的結合能力
        2.4.14 基于堿性磷酸酶的微量中和實驗測定 HAd V55 單克隆抗體中和能力
        2.4.15 293F細胞生產單克隆抗體
        2.4.16 Protein A凝膠柱純化抗體
        2.4.17 Western Blot鑒定結合表位
        2.4.18 病毒微量中和實驗鑒定中和表位
第3章 研究結果
    3.1 HAdV55特異性單克隆抗體基因獲取
        3.1.1 HAdV55候選疫苗免疫中國獼猴
        3.1.2 流式細胞儀分選HAdV55特異性記憶B細胞
        3.1.3 單細胞PCR獲取抗體基因
        3.1.4 克隆表達載體
        3.1.5 菌液PCR及測序驗證
        3.1.6 抗體表達
        3.1.7 抗體活性檢測
        3.1.8 抗體大量表達及EC₅₀、IC₅₀測定
        3.1.9 結合表位、中和表位鑒定
第4章 結論與討論
    4.1 結論
    4.2 討論
參考文獻
致謝
附錄 A 各試劑盒使用操作說明書
附錄 B 質粒載體 Heavy 鏈、Kappa 鏈、Lammbda 鏈示意圖
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果



本文編號：3856059