目的探討CD137信號是否通過抑制自噬小體與溶酶體融合促進(jìn)動脈粥樣斑塊鈣化的形成。方法實(shí)驗(yàn)分別采用ApoE^-/-小鼠和組織貼塊法原代培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)為模型,30只ApoE^-/-小鼠和原代VSMCs隨機(jī)分三組:對照組:炎癥因子混合物預(yù)刺激(TNF-α,IL-1β,INF-γ各10 ng/ml);CD137激動組:對照組+重組CD137L蛋白;CD137抑制組:對照組+抑制型CD137抗體+重組CD137L蛋白。vonKossa染色評估細(xì)胞及斑塊鈣化程度,免疫組織化學(xué)染色檢測ApoE^-/-小鼠斑塊中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin 1及p62的表達(dá)水平。采用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)鈣化及自噬相關(guān)蛋白BMP-2、Runx2、LC3I/II及p62的表達(dá)水平,應(yīng)用自噬雙標(biāo)腺病毒感染小鼠主動脈平滑肌細(xì)胞,標(biāo)記LC3蛋白,熒光倒置顯微鏡下觀察自噬流情況,通過透射電子電鏡觀察小鼠斑塊內(nèi)及小鼠平滑肌細(xì)胞內(nèi)的自噬小體的形成。結(jié)果(1)重組CD137L蛋白激動CD137信號后,Western blot顯示:...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 研究背景
        1.1.1 動脈粥樣硬化和急性冠脈綜合征
        1.1.2 CD137信號與動脈粥樣硬化
        1.1.3 自噬與動脈粥樣硬化
        1.1.4 血管鈣化及與動脈粥樣硬化
        1.1.5 CD137可能調(diào)控自噬啟動微鈣化
    1.2 研究的目的意義、內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.2.1 研究目的意義
        1.2.2 研究內(nèi)容
        1.2.3 技術(shù)路線
第二章 CD137信號通過調(diào)控自噬促進(jìn)ApoE^-/-小鼠斑塊鈣化形成
    2.1 材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 主要試劑及耗材
        2.1.3 主要溶液及成份
        2.1.4 手術(shù)器械
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)動物
    2.2 方法
        2.2.1 改良的組織貼塊法獲取原代小鼠VSMCs
        2.2.2 免疫熒光染色法鑒定原代VSMC性質(zhì)
        2.2.3 VSMCs中CD137的誘導(dǎo)
        2.2.4 構(gòu)建ApoE^-/-小鼠AS模型及動物分組處理
        2.2.5 細(xì)胞分組及細(xì)胞處理
        2.2.6 免疫組織化學(xué)染色
        2.2.7 mRFP-GRP-LC3雙標(biāo)腺病毒感染細(xì)胞
        2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬
        2.2.9 細(xì)胞蛋白的提取及Western蛋白印跡
        2.2.10 透射電鏡觀察斑塊及體外培養(yǎng)的VSMC中的自噬小體
        2.2.11 細(xì)胞及組織vonKossa鈣化染色
        2.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
        2.3.2 CM誘導(dǎo)VSMCs表達(dá)CD137分子上調(diào)
        2.3.3 CD137信號對ApoE^-/-小鼠粥樣斑塊自噬的影響
        2.3.4 CD137信號對VSMCs自噬的影響
        2.3.5 CD137信號對ApoE^-/-小鼠粥樣斑塊鈣化的影響
        2.3.6 CD137信號對VSMCs鈣化的影響
    2.4 討論
第三章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3836808