由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病復(fù)雜,神經(jīng)元處于終末分化期不具有分裂再生能力,而成體神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量非常有限,因此神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的自我恢復(fù)能力差。對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療寄希望于外源細(xì)胞的移植替代修復(fù)。已有研究表明移植神經(jīng)干細(xì)胞具有修復(fù)損傷,消除損傷灶周圍炎癥以及重塑神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)阻止內(nèi)源神經(jīng)元退行性病變的作用。人多能干細(xì)胞具有自我更新和高效分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力,為移植用神經(jīng)細(xì)胞的理想來源。因此,人多能干細(xì)胞體外分化來源的神經(jīng)干細(xì)胞對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療具有重要的臨床應(yīng)用前景。但是大量研究表明神經(jīng)干細(xì)胞移植體內(nèi)后需經(jīng)歷很長一段時間的分化成熟過程,在此過程中對細(xì)胞在體內(nèi)的存活,遷移等狀態(tài)進(jìn)行活體追蹤成為亟需解決的問題。目前活體成像追蹤技術(shù)主要有熒光成像及生物發(fā)光成像,但由于腦組織較厚,且血液和淋巴組織具有吸收光的特性,嚴(yán)重阻礙熒光或自發(fā)光的觀察。現(xiàn)有的活體示蹤技術(shù)并不能滿足目前科學(xué)研究的需求,因此需要構(gòu)建一套更為精準(zhǔn)的示蹤系統(tǒng)。Aka Lumine/Akaluc系統(tǒng)是根據(jù)生物發(fā)光成像Luciferin/Luciferase(熒光素酶)檢測系統(tǒng)改造,將luciferin底物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變,并根據(jù)底物的構(gòu)象對lu...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言與文獻(xiàn)回顧
第一章 引言
    1.1 神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病
        1.1.1 移植神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的作用
        1.1.2 神經(jīng)干細(xì)胞移植的研究前景
    1.2 體內(nèi)示蹤技術(shù)及其在神經(jīng)干細(xì)胞移植中的應(yīng)用
        1.2.1 同位素成像
        1.2.2 生物熒光成像
        1.2.3 生物發(fā)光成像
        1.2.4 生物發(fā)光成像的研究進(jìn)展
        1.2.5 生物發(fā)光成像應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞移植后的體內(nèi)追蹤
    1.3 活體示蹤中的基因編輯技術(shù)
        1.3.1 RNA引導(dǎo)的CRISPR-cas9 核酸酶技術(shù)
        1.3.2 CRISPR-cas9 核酸酶技術(shù)的研究進(jìn)展
第二章 實(shí)驗材料與方法
    2.1 實(shí)驗材料
        2.1.1 實(shí)驗細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗試劑盒
        2.1.3 實(shí)驗試劑與耗材
        2.1.4 打靶基因
        2.1.5 實(shí)驗儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗方法
        2.2.1 AAVS1定點(diǎn)敲入sg RNA的設(shè)計及其質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 sgRNA脫靶位點(diǎn)的驗證
        2.2.3 sgRNA切割效率的驗證
        2.2.4 同源重組載體的設(shè)計及相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.5 人胚胎干細(xì)胞H1的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.2.6 同源重組載體及質(zhì)粒PX330-sg RNA電轉(zhuǎn)細(xì)胞
        2.2.7 基因組的提取及PCR鑒定
        2.2.8 細(xì)胞核型檢測
        2.2.9 實(shí)時熒光定量PCR(q RT-PCR)鑒定多能性基因的表達(dá)
        2.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測多能性基因的表達(dá)
        2.2.11 畸胎瘤實(shí)驗
        2.2.12 神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)
        2.2.13 通過酶標(biāo)儀檢測生物發(fā)光
        2.2.14 通過活體成像儀檢測生物發(fā)光
        2.2.15 293T細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng)
        2.2.16 質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)
第三章 實(shí)驗結(jié)果與分析
    3.1 實(shí)驗結(jié)果
        3.1.1 驗證CRISPR/Cas9 的切割效率及脫靶位點(diǎn)
        3.1.2 構(gòu)建基因定點(diǎn)敲入AAVS1位點(diǎn)的同源重組打靶載體
        3.1.3 成功構(gòu)建AKaluc基因敲入的胚胎干細(xì)胞系
        3.1.4 H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI可以正常誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)干細(xì)胞
        3.1.5 體外鑒定H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI細(xì)胞系的示蹤能力
        3.1.6 體內(nèi)鑒定H1-AAVS1-EF1α-AKaluc-KI細(xì)胞系的示蹤能力
        3.1.7 啟動子對AKaluc表達(dá)的影響
    3.2 討論
    3.3 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
個人簡介
致謝



本文編號：3755545