目的:在肺腺癌細(xì)胞中篩選POLE2（DNA聚合酶εB亞基）基因的下游關(guān)鍵基因,進(jìn)一步研究PLK1基因的增殖及凋亡功能,驗(yàn)證PLK1基因與POLE2基因的功能相關(guān)性,初步探索POLE2基因的作用機(jī)制,為闡明POLE2基因抗腫瘤作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:（1）設(shè)計(jì)合成針對(duì)POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸單鏈,包裝完成慢病毒表達(dá)載體并感染肺腺癌A549細(xì)胞。（2）對(duì)照組（shCtrl組）及實(shí)驗(yàn)組（shPOLE2組）慢病毒轉(zhuǎn)染的肺腺癌細(xì)胞72小時(shí)后于倒置熒光顯微鏡下拍照,初步篩選轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%的細(xì)胞株,細(xì)胞狀態(tài)正常即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（3）提取shCtrl組及shPOLE2組肺腺癌細(xì)胞總RNA,采用qPCR檢測(cè)POLE2基因在mRNA水平的沉默效率。同時(shí)進(jìn)一步應(yīng)用免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)干擾靶點(diǎn)的有效性。（4）采用Trizol試劑盒對(duì)6個(gè)樣品總RNA的進(jìn)行抽提,樣品質(zhì)控合格后進(jìn)入芯片實(shí)驗(yàn):（1）差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn):符合FDR（False Discovery Rate）<0.05和︳FC︳（︳Fold Change︳）>2,且P值<0.05。（2... 

【文章來(lái)源】：延安大學(xué)陜西省

【文章頁(yè)數(shù)】：51 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞中英文對(duì)照表
第一章 引言
第二章 材料與方法
    2.1 細(xì)胞來(lái)源和細(xì)胞培養(yǎng)
    2.2 shPOLE2 慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒的產(chǎn)生及細(xì)胞感染
    2.3 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證shPOLE2 的沉默效率
    2.4 Western blot檢測(cè)POLE2 基因的沉默效率
    2.5 人類全基因組表達(dá)譜芯片分析技術(shù)篩選POLE2基因改變引起的差異基因
    2.6 生物信息學(xué)分析
    2.7 qPCR技術(shù)驗(yàn)證30個(gè)下游關(guān)鍵基因
    2.8 Western blot 檢測(cè)POLE2基因沉默后PLK1基因蛋白水平的表達(dá)變化
    2.9 shPLK1慢病毒載體的構(gòu)建、慢病毒的產(chǎn)生及細(xì)胞感染
    2.10 Western blot檢測(cè)PLK1 基因的沉默效率
    2.11 CCK-8 法檢測(cè)沉默PLK1 對(duì)于細(xì)胞增殖能力的影響
    2.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默PLK1對(duì)細(xì)胞周期的影響
    2.13 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默PLK1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
    2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第三章 結(jié)果
    3.1 檢測(cè)POLE2基因的沉默效率
    3.2 人類全基因組表達(dá)譜芯片分析技術(shù)篩選差異表達(dá)基因
        3.2.1 芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量評(píng)估
        3.2.2 基因芯片篩選下游差異基因
        3.2.3 顯著性差異基因的生物信息學(xué)分析
    3.3 利用qPCR鑒定下游30個(gè)基因在mRNA水平的表達(dá)
    3.4 沉默POLE2 后檢測(cè)下游基因PLK1在mRNA及蛋白水平表達(dá)
    3.5 檢測(cè)PLK1基因的沉默效率
    3.6 PLK1基因沉默抑制A549和NCI-H1299細(xì)胞增殖
    3.7 PLK1基因沉默對(duì)A549和NCI-H1299細(xì)胞周期的影響
    3.8 PLK1 基因沉默對(duì)A549和NCI-H1299 細(xì)胞凋亡的影響
第四章 討論
    4.1 POLE2基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用
    4.2 POLE2基因與下游基因的關(guān)系
    4.3 下游關(guān)鍵基因PLK1基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞功能的影響
第五章 結(jié)論
第六章 展望與不足
參考文獻(xiàn)
附錄1
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3643324