目的:發(fā)展一種基于微流控芯片的集成式數(shù)字化等溫擴增分析方法,并將其應用于大腸埃希菌尿路感染的快速診斷。方法:研究設計并加工了一種集成核酸提取、液滴樣品分散和數(shù)字化等溫擴增的微流控芯片。芯片核酸提取結(jié)合液滴與磁珠技術,借助于磁力驅(qū)動磁珠依次通過含有樣品裂解/結(jié)合緩沖液、洗滌液、洗脫液和反應液的一系列微池,完成細胞裂解、核酸結(jié)合、洗滌和洗脫等一系列步驟,之后將核酸提取液與環(huán)介導等溫擴增（LAMP）反應液混合;繼而,將生成的反應混合液采用負壓驅(qū)動的流體剪切方式分散為大規(guī)模液滴體系并收集于反應池中;最后,在65℃等溫條件下對反應池中液滴內(nèi)核酸進行擴增。反應后通過熒光呈像確定擴增反應陽性液滴的比例,依此使用Poisson分布算法推算出樣品中待檢靶標的數(shù)量。研究首先以大腸埃希菌標準樣品進行了分析方法發(fā)展與優(yōu)化,之后以批量尿路感染病人尿液樣本驗證分析方法的實際應用可行性。結(jié)果:本研究發(fā)展的集成式微流控芯片數(shù)字化等溫擴增分析方法能夠以“樣品進-結(jié)果出”的方式完成病原細菌定性和定量檢測。在優(yōu)化的實驗條件下,整個分析過程可在2.5 h時間內(nèi)完成。該方法的檢測動態(tài)范圍跨越4個數(shù)量級,在2.36?10

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

微流控芯片整體結(jié)構(gòu)

單個分析單元

廣州醫(yī)科大學碩士學位論文12芯片設計包含三層結(jié)構(gòu)，頂層包含核酸提取模塊的的裂解池、洗滌池、洗脫池、反應池、油相儲存池，中間層包含數(shù)字化核酸分析單元的液滴發(fā)生器與液滴反應池，底層是無結(jié)構(gòu)平板玻璃。微流控芯片每個分析單元包含上游的核酸提取模塊和下游的數(shù)字化液滴分析模塊(圖2)。核酸提取單元以狹縫串聯(lián)的4個微池，分別用來承載裂解液/磁珠、洗滌液、洗脫液和反應液。數(shù)字化液滴分析模塊包含液滴發(fā)生器以及下游的液滴反應池。液滴發(fā)生器的水相通道入口與核酸提取模塊洗脫池底部對接，而油相通道與儲油微池連接。在液滴收集池出口處施加負壓時，油相和水相溶液共同進入通道，在液滴發(fā)生器處水相在油相的剪切力作用下被切割成微小液滴，進入下游的液滴反應池。完成液滴樣品分散后，芯片反應池中的液滴在65℃下進行環(huán)介導等溫擴增反應。2.1.2芯片加工2.1.2.1核酸提取單元使用AB膠制作條形通道模具（圖3），主要是用于連接各個儲液池形成磁珠運輸通道。制作流程如下:(1)將A、B兩種膠按照1:1的比例混勻;(2)將混合好的AB膠均勻涂至固定好位置的漆包線上;(3)120℃加熱1h固化AB膠;(4)除去多余的漆包線;(5)用手術刀將通道削成長約4cm、高約1mm、寬約2mm通道;(6)用10:1比例的PDMS前體-引發(fā)劑預混物倒模，80℃加熱15min取出;(7)按標記好的位置打孔，樣品池直徑13mm，洗滌、洗脫池直徑10mm，反應池直徑5mm，儲油池直徑3.5mm。圖3AB膠制作的模具2.1.2.2通道層的加工

【參考文獻】：
期刊論文
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[3]聚合酶鏈反應在醫(yī)學檢驗中的應用和進展[J]. 李蕓.  中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生. 2017(08)
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碩士論文
[1]ITO玻璃電化學微流控芯片制作及低溫鍵合工藝研究[D]. 祁娜.大連理工大學 2008



本文編號：3584112