目的:鐵攝入系統(tǒng)是肺炎克雷伯菌一種重要的毒力因子,其轉(zhuǎn)錄受到菌體的嚴(yán)格調(diào)控。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白（Fur）是一種鐵響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,維持鐵穩(wěn)態(tài);而Rcs調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控胞外多糖的合成。目前已知鐵攝入系統(tǒng)主要受Fur調(diào)控,但關(guān)于RcsAB影響鐵攝入系統(tǒng)的研究知之甚少。腸菌素作為一種鐵載體屬于細(xì)菌的鐵攝入系統(tǒng)。entC編碼的異分支酸酶參與腸菌素的合成。通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè),在entC啟動(dòng)子區(qū)域可能存在RcsAB和Fur的結(jié)合基序。本課題旨在探究肺炎克雷伯菌NTUH-K2044轉(zhuǎn)錄調(diào)控子RcsAB和Fur對(duì)entC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。方法:CAS實(shí)驗(yàn)探究肺炎克雷伯菌NTUH-K2044和Kp:ΔrcsA、Kp:ΔrcsB、Kp:ΔrcsAB及其相應(yīng)回補(bǔ)株的鐵載體含量;用lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)測(cè)定在不同鐵含量的條件下entC基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性;在缺鐵條件下通過lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)、RT-qPCR、EMSA和DNaseΙ足跡實(shí)驗(yàn)分析RcsAB對(duì)entC基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。利用自殺質(zhì)粒pKO3-Km通過同源重組無痕敲除fur基因;在鐵充足條件下通過RT-qPCR、EMSA和DNaseΙ足跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)分析... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

placZ15-entC重組質(zhì)粒的構(gòu)建Figure2ConstructionofrecombinantplasmidplacZ15-entC

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文283.2.4缺鐵條件下RcsAB調(diào)控entC表達(dá)在普通LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC，四株菌的β-半乳糖苷酶活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）；當(dāng)在LB培養(yǎng)基中加入100μMFeSO4時(shí)，與CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶增加；當(dāng)在LB培養(yǎng)基中加入250μMDip時(shí)，與CCW01/placZ15-entC的β-半乳糖苷酶相比，其他三株菌的β-半乳糖苷酶明顯降低。因此，RcsAB在缺鐵條件下正調(diào)控entC的表達(dá)。圖4CCW01/placZ15-entC在含有0,50,100,250μMDip的LB培養(yǎng)基中β-半乳糖苷酶活性。單因素方差分析計(jì)算P值，“*”代表P<0.05，其他組均與0μMDip組進(jìn)行比較。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到平均標(biāo)準(zhǔn)差.Figure4Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entCinLBmediumwith0,50,100,250μMDip,respectively.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththe0μMDipgroup.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文29圖5CCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entC和CCW01:ΔrcsAB/placZ15-entC在不同條件下β-半乳糖苷酶活性。通過單因素方差分析計(jì)算P值，“*”代表P<0.05，其他組均與WT組進(jìn)行比較。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到平均標(biāo)準(zhǔn)差.Figure5Theβ-galactosidaseofCCW01/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsA/placZ15-entC,CCW01:ΔrcsB/placZ15-entCandCCW01:ΔrcsAB/placZ15-entCunderdifferentconditions.Pvalueswerecalculatedbyone-wayANOVA.*P<0.05，comparedwiththeWT.Shownaretheaverage±standarddeviation(SD)fromindependentexperiments.3.3RT-qPCR通過試劑盒，提取并純化了NTUH-K2044，Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB的細(xì)菌總RNA，結(jié)果見RNA瓊脂糖凝膠電泳圖6。當(dāng)LB培養(yǎng)基中加入250μMDip時(shí)，WT中entC基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Kp:ΔrcsA，Kp:ΔrcsB和Kp:ΔrcsAB（圖7）。因此，當(dāng)處于缺鐵環(huán)境時(shí)，RcsAB正調(diào)控entC的表達(dá)，這與lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鐵載體對(duì)肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)的機(jī)制研究[J]. 陳楊,劉嘉琳,瞿洪平.  中國感染與化療雜志. 2016(06)



本文編號(hào)：3499248