正常細(xì)胞的細(xì)胞膜上膽固醇含量受到嚴(yán)格調(diào)控,但多種實體腫瘤（包括前列腺癌）中存在膽固醇代謝異常。膽固醇作為細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要組成成分,在細(xì)胞膜筏中大量聚集,通過與其他脂質(zhì)和特定種類的筏蛋白相互作用來穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)域。膽固醇能夠促進(jìn)ATP5B蛋白異位到細(xì)胞膜上,并且觀察到前列腺癌細(xì)胞PC-3M的遷移侵襲能力增加,而MMP-2能降解細(xì)胞外基質(zhì)的基本骨架Ⅳ型膠原蛋白,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的組織學(xué)屏障,MMP-2的激活也依賴細(xì)胞膜。因此我們推測ATP5B異位表達(dá)后會影響MMP-2的作用。此外,課題組在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中通過免疫共沉淀技術(shù)得到了ATP5B-Cav-1蛋白復(fù)合物,Cav-1僅位于膜筏的小凹中,且將為支架蛋白維持其特有的內(nèi)凹形態(tài),作為膜筏標(biāo)志物的Cav-1被認(rèn)為是前列腺癌發(fā)展進(jìn)程中的重要蛋白。因此,為了進(jìn)一步明確細(xì)胞膜上ATP5B表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞PC-3M侵襲能力的機(jī)制影響,我們采用多種促進(jìn)及抑制模型,探究Cav-1、ATP5B以及MMP-2蛋白之間的關(guān)系。方法:1.提取細(xì)胞膜蛋白,利用免疫共沉淀方法,檢測PC-3M細(xì)胞膜表面ATP5B、Cav-1和MMP-2的結(jié)合情況。2.... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

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PC-3M細(xì)胞質(zhì)膜MMP-2與ATP5B、Cav-1蛋白結(jié)合情況

16醇負(fù)荷時間的增加而增加，在12h時表達(dá)水平最高，24h稍有下降，與ATP5B蛋白表達(dá)變化趨勢保持一致。Cav-1蛋白水平在2h時最高，說明膽固醇能最先引起Cav-1蛋白變化，隨著時間推移，Cav-1蛋白稍有下降但仍然比基礎(chǔ)表達(dá)量高，這可能與PC-3M細(xì)胞介導(dǎo)膽固醇內(nèi)流有關(guān)。以上結(jié)果表明，膽固醇可以有效促進(jìn)細(xì)胞膜表面的ATP5B以及Cav-1表達(dá)，同時MMP2的表達(dá)量也隨之提高。圖3.2膽固醇負(fù)荷不同時間后細(xì)胞膜上ATP5B、MMP-2表達(dá)變化情況A：Westernblot檢測PC-3M細(xì)胞膽固醇負(fù)荷0h、2h、6h、12h、24h時細(xì)胞膜ATP5B、MMP-2蛋白表達(dá)；B-D：0h、2h、6h、12h、24h時細(xì)胞膜ATP5B、MMP-2、Cav-1蛋白表達(dá)統(tǒng)計結(jié)果（**P<0.01、****P<0.0001，n=5）

173.3Cav-1表達(dá)下調(diào)抑制PC-3M細(xì)胞中MMP-2表達(dá)及分泌為證明3.2中膽固醇對MMP-2是否有直接影響，我們通過抑制Cav-1在PC-3M中的表達(dá)來進(jìn)行下一步實驗。3.3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選及鑒定3.3.1.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選采用Cav-1基因shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，構(gòu)建PC-3M細(xì)胞Cav-1表達(dá)下調(diào)模型。經(jīng)5μg/ml嘌呤霉素藥物篩選后，擴(kuò)大培養(yǎng)，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡中觀察PC-3M細(xì)胞Cav-1表達(dá)下調(diào)模型成功構(gòu)建（圖3.3）。細(xì)胞均發(fā)綠色熒光，通過隨機(jī)選取5個400×視野，組合同一視野下明場與熒光圖像，計算500個以上細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率達(dá)98％以上。圖3.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選（200×）3.3.1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定利用Westernblot和PCR實驗技術(shù)，分別從蛋白和mRNA水平對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，即研究轉(zhuǎn)染后Cav-1表達(dá)情況。Westernblot（圖3.4A和B）和PCR（圖3.4C和D）均發(fā)現(xiàn)：Cav-1shRNA組與scramble組相比，Cav-1的蛋白表達(dá)減少（****P<0.0001,n=3），mRNA水平下調(diào)（***P<0.001，n=3），且具統(tǒng)計學(xué)意義，說明成功獲得穩(wěn)定抑制Cav-1表達(dá)的PC-3M細(xì)胞株。


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