目的本課題組前期以減毒沙門氏菌Ty21a為載體構(gòu)建了兩種生物制劑:攜帶白細胞介素-2（interleukin-2,IL-2）/肝細胞生長因子抑制劑（hepatocyte growth factor antagonist,NK4）雙基因的減毒沙門氏菌菌株（簡稱TPIN）和攜帶角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor,KGF）和低氧誘導因子1α（hypoxia-ind ucible factor-1α,HIF-1α）雙基因的減毒沙門氏菌菌株（簡稱TPKH）,并已完成了TPIN和TPKH的藥效學和初步安全性研究。為了使TPIN和TPKH成功應用于臨床,本研究將從四個方面進行研究,包括兩種制劑的生產(chǎn)工藝優(yōu)化、質(zhì)量標準擬定、穩(wěn)定性評價和免疫性研究。方法（1）生產(chǎn)工藝優(yōu)化:分別對TPIN,TPKH進行單因素試驗,通過平板計數(shù)法計算凍干前后存活率,篩選脫脂奶粉、蔗糖、明膠以及二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）保護劑的最佳保護濃度,根據(jù)其最佳保護劑濃度設計四因素三水平正交試驗優(yōu)化復合保護劑配比,探索出分別符合TPIN,TPKH的真空冷凍干燥工藝,... 

【文章來源】：甘肅中醫(yī)藥大學甘肅省

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

生長曲線

生物制劑TPIN和TPKH的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性和免疫性研究24表1-6TPIN正交試驗表（x±s，n=3）試驗號A脫脂奶粉B蔗糖C明膠DDMSO存活率(%)1111187.049±1.7452122286.437±1.5843133380.174±2.6774212392.641±2.2045223194.326±1.5766231289.987±1.8277313284.514±1.2758321388.030±1.8719332185.809±1.018K184.55388.06888.35589.062K292.31889.59888.29686.979K386.11785.32386.33886.948R7.7654.2742.0172.113`圖1-2TPIN因素水平3.2正交試驗篩選TPKH復合保護劑配比根據(jù)單因素試驗分析選擇四種保護劑對TPIN和TPKH存活率影響最佳的濃度進行四因素三水平正交試驗，結(jié)果如表1-8所示。四種保護劑產(chǎn)生的極差大小為RA>RB>RC>RD，即四種保護劑對TPKH真空冷凍干燥后存活率的影響大小排序為脫脂奶粉、蔗糖、明膠、DMSO，其中脫脂奶粉的極差最大，表明脫脂奶粉濃度的變化對TPKH凍干效果影響最大。因此，脫脂奶粉為主要因素，蔗糖次之；對正交試驗進行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉、蔗糖、明膠和DMSO均對TPIN凍干存活率產(chǎn)生影響（P<0.01）。由圖1-3可知，TPKH凍干保護劑的最佳復合配方應為A2B2C1D1，即脫脂奶粉為15%、蔗糖為10%、明膠為1%、DMSO為0.5%。

生物制劑TPIN和TPKH的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性和免疫性研究25表1-7TPKH正交試驗表（x±s，n=3）試驗號A脫脂奶粉B蔗糖C明膠DDMSO存活率（％）1111187.366±2.7232122285.058±0.7143133381.079±3.0474212388.124±1.6355223195.191±1.3836231293.325±1.8177313278.837±1.2698321387.324±1.1029332184.171±3.577K184.50184.77689.33888.910K292.21389.19185.78585.740K383.44486.19285.03685.509R7.7124.4153.5543.400圖1-3TPKH因素水平4正交試驗驗證分析由于正交試驗得出的TPIN和TPKH的復合保護劑配方（A2B2C1D1）并未出現(xiàn)在正交試驗表中，為了進一步驗證此組合的凍干保護效果，以脫脂奶粉為15%、蔗糖為10%、明膠為1%、DMSO為0.5%對TPIN和TPKH進行凍干。結(jié)果如表1-8所示。TPIN存活率為（94.553±0.027）%，活菌數(shù)可達（4.267±0.156）×109cfu/mL，TPKH存活率為（96.064±0.031）%，活菌數(shù)可達（2.430±0.006）×109cfu/mL，其凍干效果優(yōu)于正交試驗表中的任何一組。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]攜帶低氧誘導因子-1α及角質(zhì)細胞生長因子的減毒沙門菌TPHK的構(gòu)建及其在低氧應激大鼠胃腸組織中的表達[J]. 白燕青,徐倩,曾通旭,曹薈哲,哈小琴.  中國生物制品學雜志. 2017(02)
[2]口服重組減毒沙門菌TPIN抗小鼠黑色素瘤研究[J]. 哈小琴,張尚弟,楊志華,孫琳,郭馨云,彭俊華,董菊子,張媛媛.  解放軍醫(yī)藥雜志. 2014(07)
[3]含pCMV-IL-2-IRES-NK4質(zhì)粒減毒沙門菌的制備及其穩(wěn)定性研究[J]. 楊志華,哈小琴,張尚弟,馮強生,薛榮利,楊淑娟,趙勇,楊迎桂.  解放軍醫(yī)藥雜志. 2014(07)
[4]TPIN對HepG2肝癌細胞生物學特性的影響[J]. 樊紅艷,哈小琴,張尚弟,楊志華,宋月娟,李曉云,劉延彤,徐越斌,林靜.  解放軍醫(yī)藥雜志. 2014(07)

碩士論文
[1]TPHK對應激致大鼠腸黏膜損傷的防護作用初探[D]. 楊志華.甘肅農(nóng)業(yè)大學 2012



本文編號：3447550